1.細(xì)胞以1.5×105/ml細(xì)胞數(shù)接種于直徑35ml培養(yǎng)皿中(內(nèi)放置一蓋玻片),培養(yǎng)1天,用含0.4% FCS培養(yǎng)液同步化3天,使絕大多數(shù)細(xì)胞處于G0期。
2.終止細(xì)胞培養(yǎng)前,加入BrdU(終濃度為30μg/L),37℃,孵育40min。
3.棄培養(yǎng)液,玻片用PBS洗滌3次。
4.甲醇/醋酸固定10min。
5.經(jīng)固定的玻片空氣干燥,0.3%H2O2-甲醇30min滅活內(nèi)源性氧化酶。
6.5%正常兔血清封閉。
7.甲酰胺100℃,5min變性核酸。
8.冰浴冷卻后PBS洗滌,加1抗即抗小鼠BrdU單抗(工作濃度1:50),陰性對(duì)照加PBS或血清。
9.按ABC法進(jìn)行檢測(cè),蘇木素或伊紅襯染,在顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽性細(xì)胞數(shù),計(jì)算標(biāo)記指數(shù)(LI)。