一、離心技術(shù)
離心是研究如細(xì)胞核、線粒體、高爾基體、溶酶體和微體,以及各種大分子基本手段。一般認(rèn)為,轉(zhuǎn)速為10~25Kr/min的離心機稱為高速離心機;轉(zhuǎn)速超過25Kr/min,離心力大于89Kg者稱為超速離心機。目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100Kr/min,離心力超過500Kg。
(一)、差速離心(differential centrifugation)
在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心,用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。
在差速離心中細(xì)胞器沉降的順序依次為:核、線粒體、溶酶體與過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體、最后為核蛋白體。
由于各種細(xì)胞器在大小和密度上相互重疊,而且某些慢沉降顆粒常常被快沉降顆粒裹到沉淀塊中,一般重復(fù)2~3次效果會好一些。
差速離心只用于分離大小懸殊的細(xì)胞,更多用于分離細(xì)胞器。通過差速離心可將細(xì)胞器初步分離,常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。
(二)、密度梯度離心(density gradient centrifugation)
用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度,將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部,通過重力或離心力場的作用使細(xì)胞分層、分離。這類分離又可分為速度沉降和等密度沉降平衡兩種(圖2-23)。密度梯度離心常用的介質(zhì)為氯化銫,蔗糖和多聚蔗糖。分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求:1)能產(chǎn)生密度梯度,且密度高時,粘度不高;2)PH中性或易調(diào)為中性;3)濃度大時滲透壓不大;4)對細(xì)胞無毒。
1、速度沉降
速度沉降(velocity sedimentation)主要用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。這種降方法所采用的介質(zhì)密度較低,介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。
生物顆粒(細(xì)胞或細(xì)器)在十分平緩的密度梯度介質(zhì)中按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。
2、等密度沉降
等密度沉降(isopycnic sedimentation)適用于分離密度不等的顆粒。
細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和是夠長時間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處,并停留在那里達到平衡,從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。
等密度沉降通常在較高密度的介質(zhì)中進行。介質(zhì)的最高密度應(yīng)大于被分離組分的最大密度,而且介質(zhì)的梯度要求較高的陡度,不能太平緩。再者,這種方法所需要的力場通常比速率沉降法大10~100倍,故往往需要高速或超速離心,離心時間也較長。大的離心力、長的離心時間都對細(xì)胞不利。大細(xì)胞比小細(xì)胞更易受高離心力的損傷,而且停留在等密度介質(zhì)中的細(xì)胞比處在移動中的細(xì)胞受到更大的損傷。因此,這種方法適于分離細(xì)胞器,而不太適于分離和純化細(xì)胞。
二、流式細(xì)胞術(shù)
流式細(xì)胞術(shù)是對單個細(xì)胞進行快速定量分析與分選的一門技術(shù)。在分析或分選過程中,包在鞘液中的細(xì)胞通過高頻振蕩控制的噴嘴,形成包含單個細(xì)胞的液滴,在激光束的照射下,這些細(xì)胞發(fā)出散射光和熒光,經(jīng)探測器檢測,轉(zhuǎn)換為電信號,送入計算機處理,輸出統(tǒng)計結(jié)果,并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細(xì)胞亞群,分離純度可達99%。包被細(xì)胞的液流稱為鞘液,所用儀器稱為流式細(xì)胞計(flow cytometer)。
三、細(xì)胞電泳
在一定PH值下細(xì)胞表面帶有凈的正或負(fù)電荷,能在外加電場的作用下發(fā)生泳動,這種現(xiàn)象稱為細(xì)胞電泳(cell electrophoresis)。引起細(xì)胞電泳的電位值稱為ξ電位。各種細(xì)胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細(xì)胞荷電量有所不同,故在一定的電場中的泳動速度不同。在恒定的電場條件下,同種細(xì)胞的電泳速度相當(dāng)穩(wěn)定,因而可通過測定電泳速度來推算出細(xì)胞的ξ電位。ξ電位常因細(xì)胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)而異,因此在診斷疾病上有一定價值。此外由于不同類型的細(xì)胞在電場中的泳動速度不同,細(xì)胞電泳尚可用來分離不同種類的細(xì)胞,例如可把淋巴樣細(xì)胞與造血細(xì)胞分開。