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原位末端標(biāo)記技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

一、DNA聚合酶或Klenow大片段介導(dǎo)的原位缺口平移(ISNT)
1.切片常規(guī)脫蠟,梯度乙醇復(fù)水化。
2.將切片組織浸入2×SSC液中,80℃,20min,然后蒸餾水沖盡。
3.0.5%胃蛋白酶(pH2.0)37℃消化0~20min,PBS洗盡。
4.用濾紙擦干組織塊周邊液體放入濕盒組織切片上滴加緩沖液A,5min。緩沖液A:50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巰基乙醇,0.005%BSA,pH7.5。
5.棄去緩沖液A,滴加標(biāo)記液約50μl,25℃溫育1h。標(biāo)記反應(yīng)液:0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
6.PBS漂洗2次,各3min。
7.內(nèi)源酶阻斷劑阻斷15min。
8.PBS洗2次,各3min。
9.滴加HRP-avidin覆蓋組織,室溫下30min。
10.PBS洗2次,各3min。
11.DAB-H2O2顯色約5min。
12.流水沖洗后,蘇木素復(fù)染1min。常規(guī)脫水,透明,封片。
13.陰性對照片在第5步改加不含Klenow的標(biāo)記液,余同。

二、TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)
1.切片常規(guī)脫蠟,復(fù)水,后續(xù)過程在濕盒內(nèi)進(jìn)行。
2.3%的H2O2阻斷內(nèi)源性辣根過氧化物酶30min。
3.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
4.切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
5.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
6.蛋白酶K或胃蛋白酶消化0~20min。
7.0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
8.TdT緩沖液孵育10min。
9.TdT反應(yīng)液37℃孵育1h。
10. 切片浸泡在2×SSC溶液10min,以終止反應(yīng)。
11. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
12. 鏈卵白素標(biāo)記的辣根過氧化物酶孵育30min。
13. 0.15mol/L的PBS洗2次,每次5min。
14. 0.04%的DAB顯色5~10min,鏡下控制時間。
15. 蘇木素復(fù)染3~5min,常規(guī)復(fù)水,透明和封片。

 
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