蛋白濃度測定的方法有很多,但每種方法都有其特點和局限性,因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當?shù)姆椒,以滿足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果精確,但操作復(fù)雜,用于大批量樣品的測試則不太合適;Lowry法精確度較高,但是比較費時,且每步的時間要求相對嚴格;Bradford法靈敏簡便,但易受去垢劑的影響;BCA法以其試劑穩(wěn)定,抗干擾能力強,結(jié)果穩(wěn)定,靈敏度高而受歡迎。
2. BCA法:
原理:在堿性環(huán)境下,蛋白質(zhì)將銅離子還原成亞銅離子,二喹啉甲酸(BCA)與亞銅離子形成紫色的絡(luò)合物,這種絡(luò)合物溶于水并在562nm處產(chǎn)生光吸收峰值,光吸收強度在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)含量呈近似線性關(guān)系,因此使用比色法可以對蛋白質(zhì)進行檢測和定量。BCA法沒有反應(yīng)終點,反應(yīng)會隨著時間而持續(xù)進行;通過一段時間的孵育后,反應(yīng)速度會變慢,從而可以對大量樣品進行檢測。
優(yōu)點:
1. 靈敏度高,可以檢測到低至0.5μg/mL的蛋白質(zhì)。
2. 對蛋白質(zhì)分子量沒有要求,小分子量肽也可檢測。
3. 結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好。
4. 可用于高通量的蛋白質(zhì)測定。
5. 與Bradford法相比,可耐受一定濃度的去垢劑。
缺點:
1. 受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響:EDTA小于10mM,DTT和巰基乙醇均低于1mM。
2. 對不同蛋白質(zhì)的反應(yīng)性不同,因此不同蛋白質(zhì)靈敏度有差異。
3. 與Bradford法相比,操作相對較復(fù)雜,需要多個步驟。