一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由于過柱純化而樣品變得很稀,為了保存和鑒定的目的,往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的:
1、減壓加溫蒸發(fā)濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低,減壓的真空度愈高,液體沸點降得愈低,蒸發(fā)愈快,此法適用于一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發(fā)濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發(fā),鋪成薄層的溶液,表面不斷通過空氣流;或?qū)⑸锎蠓肿尤芤貉b入透析袋內(nèi)置于冷室,用電扇對準吹風(fēng),使透過膜外的溶劑不沁蒸發(fā),而達到濃縮目的,此法濃縮速度慢,不適于大量溶液的濃縮。
3、冰凍法 生物大分子在低溫結(jié)成冰,鹽類及生物大分子不進入冰內(nèi)而留在液相中,操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體,然后緩慢地融解,利用溶劑與溶質(zhì)融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質(zhì)和酶的鹽溶液用此法濃縮時,不含蛋白質(zhì)和酶的純冰結(jié)晶浮于液面,蛋白質(zhì)和酶則集中于下層溶液中,移去上層冰塊,可得蛋白質(zhì)和酶的濃縮液。
4、吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學(xué)反應(yīng),對生物大分子不吸附,易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等,使用聚乙二醇吸收劑時,先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋里,外加聚乙二醇復(fù)蓋置于4度下,袋內(nèi)溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水飽和后要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質(zhì)分子進行選擇性過濾的方法,不液體在一定壓力下(氮氣壓或真空泵壓)通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留,這是近年來發(fā)展起來的新方法,最適于生物大分子尤其是蛋白質(zhì)和酶的濃縮或脫鹽,并具有成本低,操作方便,條件溫和,能較好地保持生物大分子的活性,回收率高等優(yōu)點。應(yīng)用超濾法關(guān)鍵在于膜的選擇,不同類型和規(guī)格的膜,水的流速,分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量值)等參數(shù)均不同,必須根據(jù)工作需要來選用。另外,超濾裝置形式,溶質(zhì)成份及性質(zhì)、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值:
膜名稱 |
分子量截留值 |
孔的大的平均直徑 |
XM-300 |
300,000 |
140 |
XM-200 |
100,000 |
55 |
XM-50 |
50,000 |
30 |
PM-30 |
30,000 |
22 |
UM-20 |
20,000 |
18 |
PM-10 |
10,000 |
15 |
UM-2 |
1,000 |
12 |
UM05 |
500 |
10 |
用上面的超濾膜制成空心的纖維管,將很多根這樣的管攏成一束,管的兩端與低離子強度的緩沖液相連,使緩沖液不斷地在管中流動。然后將纖維管浸入待透析的蛋白質(zhì)溶液中。當緩沖液流過纖維管時,則小分子很易透過膜而擴散,大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法,由于透析面積增大,因而使透析時間縮短10倍。
二、干燥
生物大分子制備得到產(chǎn)品,為防止變質(zhì),易于保存,常需要干燥處理,最常用的方法是冷凍干燥和真空干燥。真空干燥適用于不耐高溫,易于氧化物質(zhì)的干燥和保存,整個裝置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外,同時增加了溫度因素。在相同壓力下,水蒸汽壓隨溫度下降而下降,故在低溫低壓下,冰很易升華為氣體。操作時一般先將待干燥的液體冷凍到冰點以下使之變成固體,然后在低溫低壓下將溶劑變成氣體而除去。此法干后的產(chǎn)品具有疏松、溶解度好、保持天然結(jié)構(gòu)等優(yōu)點,適用于各類生物大分子的干燥保存。
三、貯存
生物大分子的穩(wěn)定性與保存方法的很大關(guān)系。干燥的制品一般比較穩(wěn)定,在低溫情況下其活性可在數(shù)日甚至數(shù)年無明顯變化,貯藏要求簡單,只要將干燥的樣品置于干燥器內(nèi)(內(nèi)裝有干燥劑)密封,保持0-4度冰箱即可,液態(tài)貯藏時應(yīng)注意以下幾點。
1、樣品不能太稀,必須濃縮到一定濃度才能封裝貯藏,樣品太稀易使生物大分子變性。
2、一般需加入防腐劑和穩(wěn)定劑,常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質(zhì)和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等,如酶也可加入底物和輔酶以提高其穩(wěn)定性。此外,鈣、鋅、硼酸等溶液對某些酶也有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸鈉的標準緩沖液中。
3、貯藏溫度要求低,大多數(shù)在0度左右冰箱保存,有的則要求更低,應(yīng)視不同物質(zhì)而定。