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蛋白質(zhì)的分離純化

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-04-26

 

一,蛋白質(zhì)(包括酶)的提取

  大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液,少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中,因些,可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

(一)水溶液提取法

  稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑,通常用量是原材料體積的1-5倍,提取時需要均勻的攪拌,以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面,多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大,因此,溫度高利于溶解,縮短提取時間。但另一方面,溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活,因此,基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解,可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸,碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
  蛋白質(zhì),酶是具有等電點的兩性電解質(zhì),提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時,應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化,一般來說,堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取,而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。
2、鹽濃度
  稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶,稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合,具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點,因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽,一般以0.15摩爾。升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

(二)有機溶劑提取法

  一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶,不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中,可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑,它們具的一定的親水性,還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越,一是因為丁醇親脂性強,特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性,在溶解度范圍內(nèi)(度為10%,40度為6.6%)不會引起酶的變性失活。另外,丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣,也適用于動植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)的分離純化方法很多,主要有:

(一)根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法

1、蛋白質(zhì)的鹽析
  中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質(zhì)的溶解度增加,此稱鹽溶;當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析,將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中,高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力,可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層,使之“失水”,于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同,故鹽析所需的鹽濃度也不一樣,因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
  影響鹽析的因素有:(1)溫度:除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫(4度)操作外,一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低,更容易鹽析。(2)pH值:大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。(3)蛋白質(zhì)濃度:蛋白質(zhì)濃度高時,欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(共沉現(xiàn)象)。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋,使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。
  蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽,主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應(yīng)用最多的硫酸銨,它的優(yōu)點是溫度系數(shù)小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M,即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M,即676克/升),在這一溶解度范圍內(nèi),許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好,不易引起蛋白質(zhì)變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間,當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時,需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。
  蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后,需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去,常用的辦法是透析,即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)(常用的是玻璃紙),用緩沖液進(jìn)行透析,并不斷的更換緩沖液,因透析所需時間較長,所以最好在低溫中進(jìn)行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽,所用的時間就比較短。

2、等電點沉淀法
  蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質(zhì)的等電點有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結(jié)合用。

3、低溫有機溶劑沉淀法
  用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質(zhì)較易變性,應(yīng)在低溫下進(jìn)行。

(二)根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法

1、透析與超濾
  透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開。
  超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質(zhì)分子通過半透膜,而蛋白質(zhì)留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。

2、凝膠過濾法
  也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。

(三)根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離

蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同,可將其分開。

1、電泳法
  各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質(zhì)作為載體,電泳時兩性電解質(zhì)形成一個由正極到負(fù)極逐漸增加的pH梯度,當(dāng)帶一定電荷的蛋白質(zhì)在其中泳動時,到達(dá)各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質(zhì)。

2、離子交換層析法
  離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素),當(dāng)被分離的蛋白質(zhì)溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質(zhì)被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質(zhì)洗脫下來。(詳見層析技術(shù)章)

(四)根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法

  親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質(zhì)的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質(zhì)從很復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質(zhì)與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結(jié)合。其基本原理:蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類型的細(xì)胞都含有上千種不同的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)的分離(Separation),提純(Purification)
和鑒定(Characterization)是生物化學(xué)中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)中提取出來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。

 
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