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氣相色譜層析

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

(一)基本原理

混合樣品的氣流通過固定相時(shí),根據(jù)各組分對(duì)固定相的吸附強(qiáng)弱不同使不同成分得到分離。

利用氣相色譜層析技術(shù)做為微生物診斷的工具已成功地用于微生物的分類和鑒定。該法敏感性強(qiáng),能夠分離和檢測到毫微克的水平。它具有快速的特點(diǎn),常在數(shù)十分鐘甚至數(shù)小時(shí)就可以對(duì)傳染病做出早期診斷。其結(jié)果穩(wěn)定,重復(fù)性好,但不足之處是操作中各因素不易控制,方法不易標(biāo)化等。

(二)氣相色譜儀的基本部件

1. 載氣 常用的載氣主要有氮、氬、氫和二氧化碳等。這些氣體一般都由高壓氣瓶供給。

2. 進(jìn)樣器 氣相色譜儀可以用于分離固相、氣相和液相標(biāo)本。液相標(biāo)本采用微升注射器穿過橡皮隔片注入,氣相標(biāo)本采用特種氣相注射器注入。

3. 譜柱及加熱爐 色譜柱一般由金屬或玻璃制成,通常采用的柱長2m~4m,內(nèi)徑2mm, 毛細(xì)管柱長度可達(dá)20m~150m,內(nèi)徑為0.2mm。

載體一般采用惰性、多孔的固體顆粒。多由硅藻土或玻璃珠制成,分析不同極性的微生物化合物,為了獲得最適的分離條件,要求有不同固定相的載體。目前比較常用的載體有:聚乙二醇(CarbOwax 20M)、F F A P(聚乙二醇20M和2-硝基對(duì)苯二甲酸的反應(yīng)產(chǎn)物),OV—17(苯基甲基硅酮)。OV-210、SE-30(甲基硅酮)、Chromosorb G(白色硅藻土載體)等。柱加熱爐在溫度控制上是非常重要的。

4. 紀(jì)錄儀

5. 數(shù)據(jù)處理裝置 一般均附有數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)。

 

(三)試驗(yàn)條件的選擇

1. 色譜柱的選擇 要注意極性及最高使用溫度,柱溫不能超過最高使用溫度。固定相按極性相似的原則選擇。

色譜柱的內(nèi)徑大小、長度都能影響分離率。一般而言,內(nèi)徑越小,長度越長,分離效果越好,一般柱長為1m~5m(毛細(xì)管柱則20m~100m)。

填充劑顆粒一般采用40目~60目,60目~80目及80目~100目大小。長柱子宜用粒度大些的,以減少柱壓降,短柱子則用粒度細(xì)的。

氣相色譜中固定液的含量對(duì)分離效率的影響較大。一般采用固定液與載體重量之比為15︰100~25︰100。采用高靈敏度的檢測器,由于進(jìn)樣量減少,固定液含量可以降至5︰100以下。這樣可以使用較低柱溫,從而提高柱效,縮短分析時(shí)間。但固定液用量太少會(huì)引起吸附。

2.柱溫選擇 柱溫選擇對(duì)分離度影響很大,常是條件選擇的關(guān)鍵。選擇的基本原則是:在使最難分離的組分有盡可能好的分離高度的前提下,盡可能采取較低溫度,但以保留時(shí)間適宜及不拖尾為度。

⑴ 高沸點(diǎn)混合物(200℃~400℃),若需在較低的柱溫下分析,可采用低固定液配比1%~3%,采用高靈敏檢測器,柱溫可比沸點(diǎn)低100℃~150℃,在200℃~250℃的柱溫下分析。

⑵ 沸點(diǎn)<300℃的樣品,可用3%~25%固定液配比。沸點(diǎn)越低,所用配比越高,柱溫可比平均沸點(diǎn)低50℃至平均沸點(diǎn)的范圍選擇。

3.載體選擇 載體采用低線速時(shí),宜用氮?dú)猓桓呔速時(shí)用氫氣。柱越長,柱內(nèi)有較大壓力降,宜用氫氣。載氣采用低線速時(shí)為20ml~80ml/min。

4.其它條件

⑴ 氣化室溫度及檢測室溫度選擇:氣化溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點(diǎn)、穩(wěn)定性以及進(jìn)樣量,一般選擇稍高于樣品沸點(diǎn),但不要超過沸點(diǎn)50%以上,以防分解。檢測室溫度需高于柱溫,一般高于柱溫30℃左右或與氣化室同溫。

⑵ 進(jìn)樣量:固定相在配比15%~35%的層析柱時(shí),最大進(jìn)樣量液體為10μl,氣體為10ml。一般樣品量液體4μl,氣體為0.5ml~3ml,固體小于1mg。

⑶ 橋電位選擇:散熱多和選擇大的橋電位,在靈敏度相同的情況下,應(yīng)盡量選擇低橋電位,以保護(hù)熱敏元件。

(四)填充柱的制備

1.稱取一定量的載體于蒸發(fā)皿中,加2倍于載體體積的低沸點(diǎn)溶劑(氯仿丙酮、三氯甲烷等),使之溶解。

2.取適量的固定液,倒入蒸發(fā)皿中,拌勻。注意應(yīng)使載體全部覆蓋在液面下,于紅外燈下緩緩加熱,不時(shí)輕輕攪拌,待溶液全部揮發(fā)。

3.先將柱的一端用玻璃毛輕輕堵上,接上吸濾真空泵,柱的另一端接上漏斗,將填充劑從漏斗加入,同時(shí)啟動(dòng)真空泵,不時(shí)輕敲柱子各部,以使填充均勻。裝滿后,關(guān)閉真空泵,取下色譜柱,將加樣的一端也填上一小團(tuán)玻璃毛。

4.將柱裝入色譜柱中,在通載氣前,先將爐溫升至略高于操作溫度,保持約1h,以使固定液受熱熔化或粘度減小,在載體表面流布均勻,然后再通入載氣,使色譜柱在操作溫度下,通載氣數(shù)小時(shí)。

(五)樣品處理

以細(xì)菌培養(yǎng)物樣品的處理為例。

1.取3~5個(gè)菌落,接種于2ml含有3%葡萄糖TSB肉湯(即含胰酶1.42%、植物胨 0.25%、K2H PO4 0.25%NaCl、0.42%的肉湯)內(nèi),35℃~38℃培養(yǎng)3h。

2.于培養(yǎng)物中加2ml 5Mol/L H2SO4、H2O和CH3OH(1︰3︰16),混合后,再加4ml醋酸乙脂浸取,混勻,靜置片刻。

3.4 000r/min離心15min,棄沉淀。

4.取上清液加等量乙醚提取,收集乙醚層。

5.于水層中再加上述比例的5 Mol/L H2 SO4、H2O和CH3OH混合物。

6.于混合物中加等量氯仿提取,分層,收集氯仿層,棄去水層。

7.將乙醚層與氯仿層合并,揮發(fā)濃縮至0.01ml,加10μg已二酸作內(nèi)標(biāo)物,再加20μg甲氯基胺-HCl。

8.于混合物中加0.2ml吡啶,再加0.2ml TRI-SIL-BSA和0.05ml TMOS,混勻,60℃孵育1h,離心,去沉淀。

9.上清即可制譜。

(六)操作方法

1.按流程圖并參考儀器使用說明書,將有關(guān)設(shè)備安裝好,檢查各系統(tǒng)各接頭是否漏氣,確定無誤后,可開始操作。

2.打開氣流總閥門,調(diào)節(jié)表頭上的減壓閥,使氣體壓力為22kg/cm2左右,調(diào)節(jié)穩(wěn)壓器針形閥,使載氣流速控制在所需要的流速值。

3.加熱色譜柱至所需的柱溫并控制此溫(根據(jù)儀器恒溫箱的性能控制溫度波動(dòng)值在一定的范圍之內(nèi),如±0.5℃)。一般所用的柱溫是在被分析物質(zhì)的平均沸點(diǎn)左右或更低一些。若被分析物的沸程太寬,則可用程序升溫法來升高柱溫。

4.加熱進(jìn)樣器(氣化室),使溫度高于樣品沸點(diǎn)的最高組分的沸點(diǎn)。

5.加熱檢測器恒溫箱,使溫度與柱溫一樣或高于一定的值。

6.氣流和溫度均達(dá)穩(wěn)定后,給檢測器通電流。若采用氫火焰離子化檢測器則啟動(dòng)微電流放大器部分。

7.調(diào)檢樣器為零點(diǎn),待穩(wěn)定后,即可開始進(jìn)樣。

(七)結(jié)果分析

氣相色譜層析是一種分離分析的方法,因此它的特點(diǎn)是適合于多組分混合物的定性和定量分析。

1.定性 對(duì)于一已知范圍的混合物,用此法定性很容易,但對(duì)于范圍未知的混合物來說,則需要配合化學(xué)分析及其它儀器分析等。

⑴ 利用保留值定性法:同一種物質(zhì)在一根層析柱上保留時(shí)間相同。取樣品各可能組分的純物質(zhì)加入樣品中,混合進(jìn)樣,對(duì)此加入后的色譜圖,若某色譜峰相對(duì)譜高,則該色譜峰的組分與純物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。

⑵ 化學(xué)反應(yīng)定性法:即把色譜柱的流出物,通過官能團(tuán)試劑中,觀察試劑的顏色是否發(fā)生變化或是否有沉淀,而判斷該組分含什么官能團(tuán)或?qū)儆诤晤惢衔铩?/p>

⑶ 兩譜聯(lián)用定性法:即利用質(zhì)譜儀、紅外分光光度計(jì)等來進(jìn)行測定,定性。

2.定量 在實(shí)驗(yàn)條件恒定時(shí),峰面積或峰高與組分的含量成正比,因此可以利用峰面積或峰高面積或峰高來進(jìn)行定量。對(duì)于微生物標(biāo)本的氣相色譜分析常根據(jù)以下幾點(diǎn)來進(jìn)行比較。

⑴ 峰的有無和峰的大小。

⑵ 按10個(gè)重復(fù)標(biāo)本分析計(jì)算的平均t值(標(biāo)準(zhǔn)差)。

⑶ 同標(biāo)準(zhǔn)化合物的相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行對(duì)比,而對(duì)某化合物做出鑒定。

 
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