由于各家公司生產(chǎn)的熱循環(huán)儀提供的各種實驗方案不太一致，所以優(yōu)化的策略也不盡相同，然而在各種方案中，前文所述的那些影響實時PCR 反應的因素卻總是相通的。只要能較好地控制實驗條件，優(yōu)化實驗步驟，要想獲得滿意的實驗結果并不一定都是困難的。下面本文將就影響到實驗結果的一些基本參數(shù)和實驗步驟談一談關于實時定量PCR的優(yōu)化。
1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：
1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應選擇的濃度為4－8mM。
1.2 模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進行實驗。一般而言，使Cp位于15－30個循環(huán)比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I測定DNA時的條件優(yōu)化：
2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對其的要求是2－4 mM。
2.2模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。基因組DNA在50ng-5pg之間選擇，質粒DNA在10^6拷貝數(shù)左右選擇。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達到好的效果，反會使反應的敏感度降低，所以，研究者若要進行實時定量PCR研究，最好選用純化的模板。
2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，其濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應，0.5uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.3－1.0uM之間進行選擇，直至達到滿意的結果。
2.6 退火溫度：首次實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內進行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定，這個經(jīng)驗值往往會同計算得到的Tm值有較大的差距。
3. 用SYBR Green I進行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化：
3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。
3.2模板的濃度：RT－PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進行測定。
3.3對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。
4. 雜交探針測定DNA
4.1 MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。
4.2雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。
4.4 其它的條件同SYBR Green I。
5 用雜交探針實時定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的濃度：在4－8mM之間進行選擇。
5.2雜交探針的濃度：初實驗用0.2 uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板濃度設置：優(yōu)化的擴增須進行一系列知釋度的實驗，在條件有困難的條件下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。
5.4 對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。
6.關于雜交探針的評價：在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，致反應的效率下降。探針其本身能同目的基因相結合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端完全磷酸化。
目前的實時定量PCR技術進展迅速，本文是結合本實驗室的工作經(jīng)驗以及文獻資料寫成的，文中提到的一系列方案、實驗材料和儀器設備都有其各自的優(yōu)缺點，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進行何種研究，都應根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運用實時定量PCR進行研究的人員參考
1. 基本參數(shù)的優(yōu)化：
1.1 MgCl2的濃度 在PCR反應中，MgCl2的濃度對影響酶的活性是至關重要的，不僅如此，合適的MgCl2的濃度還能在反應中得到較低的Cp(crossing point)值，較高的熒光信號強度以及良好的曲線峰值。所以對其的深度選擇應慎重。一般來說，對以DNA或cDNA為模板的PCR反應，應選擇2－5mM濃度的MgCl2，對以mRNA為模板的RT－PCR而言，則應選擇的濃度為4－8mM。
1.2 模板的濃度：如果研究者是進行首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗，以選擇出最為合適的模板濃度，如果條件困難，也至少要選擇兩個稀釋度（高和中、低濃度）來進行實驗。一般而言，使Cp位于15－30個循環(huán)比較合適，若大于30則應使用較高的模板濃度，如果Cp小于15則應選擇較低的模板深度。對于Cp值的確定，經(jīng)驗上是SYBR Green I探針的熒光信號比本底高2倍，雜交探針的熒光強度比本底高0.3倍。
2. 使用SYBR Green I測定DNA時的條件優(yōu)化：
2.1 MgCl2的濃度：大多數(shù)引物－模板對其的要求是2－4 mM。
2.2模板的濃度：初次實驗要求做一系列的稀釋濃度，如條件限制，至少完成兩個稀釋的度的測定。基因組DNA在50ng-5pg之間選擇，質粒DNA在10^6拷貝數(shù)左右選擇。
2.3 PCR抑制子：通常用于消除抑制子的辦法是將樣本進行稀釋，但是在某些條件下，抑制子的濃度高，而模板量少，稀釋法就不再能達到好的效果，反會使反應的敏感度降低，所以，研究者若要進行實時定量PCR研究，最好選用純化的模板。
2.4 引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，其濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應，0.5uM是個合適的濃度，若初次選用這個濃度不理想，可在0.3－1.0uM之間進行選擇，直至達到滿意的結果。
2.6 退火溫度：首次實驗設置的退火溫度應比計算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃內進行選擇。一般地，退火溫度要根據(jù)經(jīng)驗來確定，這個經(jīng)驗值往往會同計算得到的Tm值有較大的差距。
3. 用SYBR Green I進行一步法RT－PCR的條件優(yōu)化：
3.1 MgCl2的濃度：不同的靶分子選用不同的濃度，通常是在4－8mM之間選擇。
3.2模板的濃度：RT－PCR實驗既可以選用總RNA，又可以選用mRNA，其濃度應在1pg-1ug之間選擇。對于低模板濃度，可以增加適量的MS2或用alternative RNA 作為載體進行測定。
3.3對照設置：每一引物都應設有陰性對照，陽性對照和污染對照。
4. 雜交探針測定DNA
4.1 MgCl2的濃度：在2－4mM的基礎上加0.5－1.0mM，但是不要超過2.0mM。
4.2雜交探針的濃度：初次實驗每個探針用0.2uM，如果信號強度達不到要求，可以增加至0.4uM。
4.3對照設置：每一引物都要設陰性對照，每一探針都要設陰性對照。每次實驗都要設陽性對照。
4.4 其它的條件同SYBR Green I。
5 用雜交探針實時定量RT－PCR：
5.1 MgCl2的濃度：在4－8mM之間進行選擇。
5.2雜交探針的濃度：初實驗用0.2 uM，如果熒光信號強度不足，可以增加至0.4uM。
5.3模板濃度設置：優(yōu)化的擴增須進行一系列知釋度的實驗，在條件有困難的條件下，至少要進行兩個稀釋度的測定。選用1pg-1ug的總RNA或是mRNA，若是模板的濃度過小（小于10ng/ul）,則可加入MS2或alternative RNA作為載體。
5.4 對照設置：每個引物都要設無模板對照，陽性對照以及污染對照。
6.關于雜交探針的評價：在使用雜交探針進行實驗時，必須注意防止探針－引物二聚體的形成和其本身在反應過程中的延伸。引物－探針二聚體的形成，主要是因為探針可與引物的3’末端雜交，其形成以后，會致使此二聚體擴增，從而同目的基因競爭反應的原料，致反應的效率下降。探針其本身能同目的基因相結合，且其解鏈溫度高于引物，所以它可能作為引物而引發(fā)延伸反應，為了防止發(fā)生這種現(xiàn)象，通常是將其3’末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是沒有磷酸化，就會產(chǎn)生目的基因的副產(chǎn)品，從而干擾實驗結果。鑒于以上這兩點，所以應對探針精心設計，并將其末端完全磷酸化。
目前的實時定量PCR技術進展迅速，本文是結合本實驗室的工作經(jīng)驗以及文獻資料寫成的，文中提到的一系列方案、實驗材料和儀器設備都有其各自的優(yōu)缺點，也有各自的使用范圍，不能一概而論。所以不論研究者想進行何種研究，都應根據(jù)自己的情況首先找到適合自己研究目的的條件，本文僅供有意于運用實時定量PCR進行研究的人員參考
