1．凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質(zhì)單體，G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。

2．凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過(guò)量的緩沖液在冰箱（或室溫）中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復(fù)數(shù)次即可。

3．裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類(lèi)和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí)，柱床體積應(yīng)為樣品體積的25～100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長(zhǎng)一些，分離效果好，但柱太長(zhǎng)，則延長(zhǎng)分離時(shí)間，樣品也稀釋過(guò)度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過(guò)細(xì)，會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰5～1︰25；對(duì)于純化蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)應(yīng)為1︰20～1︰100。

裝柱過(guò)程基本同離子交換層析柱。

4．加樣與洗脫 樣品體積不宜過(guò)多，最好為床體積的1％～5%，最多不要超過(guò)10%。樣品濃度也不宜過(guò)大，濃度過(guò)大粘度大，分離效果差，一般不超過(guò)4%。

洗脫液應(yīng)與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會(huì)發(fā)生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液（0.14Mol/L NaCl）。

5．洗脫液收集 同離子交換層析。

6．凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來(lái)之后，即可加入新的樣品，繼續(xù)使用。保存方法有三種：

⑴ 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑（一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態(tài)下保存。

⑶ 長(zhǎng)期不用者，最好以干燥狀態(tài)保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。