膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質(zhì)的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結(jié)合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質(zhì)的等電點時，則會聚集而失去結(jié)合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質(zhì)的分子量等都影響禾褰鷯氳鞍字實慕岷稀?B>
1．待標記蛋白溶液的制備 將待標記蛋白預(yù)先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4℃離心1h，去除聚合物。
2．待標膠體金溶液的準備 以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl調(diào)膠體金液的pH值。標記IgG時，調(diào)至9.0；標記McAb時,調(diào)至8.2；標記親和層析抗體時，調(diào)至7.6；標記SPA時，調(diào)至5.9～6.2；標記ConA時，調(diào)至8.0；標記親和素時，調(diào)至9～10。
由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調(diào)節(jié)pH時，采用精密pH試紙測定為宜。
3．膠體金與標記蛋白用量之比的確定
（1）根據(jù)待標記蛋白的要求，將膠體金調(diào)好pH之后，分裝10管，每管1ml。
（2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml～50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。
（3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10％NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結(jié)果。
（4）結(jié)果觀察，對照管（未加蛋白質(zhì)）和加入蛋白質(zhì)的量不足以穩(wěn)定膠體金的各管，均呈現(xiàn)出由紅變藍的聚沉現(xiàn)象；而加入蛋白量達到或超過最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變。以穩(wěn)定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質(zhì)用量，即為該標記蛋白質(zhì)的最低用量，在實際工作中，可適當增加10％～20％。
4．膠體金與蛋白質(zhì)（IgG）的結(jié)合 將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調(diào)pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續(xù)攪拌10min，加入一定量的穩(wěn)定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發(fā)生沉淀。常用穩(wěn)定劑是5％胎牛血清（BSA）和1％聚乙二醇（分子量20KD）。加入的量：5％BSA使溶液終濃度為1％；1％聚乙二醇加至總?cè)芤旱?／10。
5．膠體金標記蛋白的純化
（1）超速離心法：根據(jù)膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩(wěn)定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。
用BSA做穩(wěn)定劑的膠體金—羊抗兔IgG結(jié)合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結(jié)合物用6 000g，4℃離心1h；20nm～40nm膠體金結(jié)合物，14 000g，4℃離心1h。仔細吸出上清，沉淀物用含1％BSA的PB液（含0.02％NaN3），將沉淀重懸為原體積的1／10，4℃保存。如在結(jié)合物內(nèi)加50％甘油可貯存于-18℃保存一年以上。
為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結(jié)合物再進一步用10％～30％蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結(jié)合物。
（2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩(wěn)定劑的膠體金蛋白結(jié)合物的純化。將膠體金蛋白結(jié)合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1／5～1／10。再經(jīng)1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1／10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內(nèi)含0.1％BSA，0.05％NaN3，pH8.2者用IgG標記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁，內(nèi)含大顆粒聚合物等雜質(zhì)。繼之為純化的膠體金蛋白結(jié)合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結(jié)合物過濾除菌、分裝,4℃保存。最終可得到70％～80％的產(chǎn)量。
6．膠體金蛋白結(jié)合物的質(zhì)量鑒定
（1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網(wǎng)（銅網(wǎng)也可）蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復(fù)染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。
（2）膠體金溶液的OD520nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm～550nm之間出現(xiàn)最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1％BSA，0.02％NaN3）將膠體金蛋白試劑作1︰20稀釋，OD520＝0.25左右。一般應(yīng)用液的OD520應(yīng)為0.2～0.4。
（3）金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MF－IGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經(jīng)銀顯影來檢測相應(yīng)的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。