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DNA的酶切與連接

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-02
    (1)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl,10×Buffer 1μl,DNA 2μl,酶1μl,混勻,37℃水浴1h以上。
   (2)取反應(yīng)物點樣,觀察酶切效果。
  (3)酶切完全后,70℃5min終止反應(yīng)。
 。4)加2倍體積的預(yù)冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻,-20℃2h以上。
 。5)15000rpm離心15min,棄上清。
 。6)加入75%乙醇洗滌2次,離心棄上清,真空抽干。
 。7)加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。
  (8)測定DNA的含量。
  (9)加入線性載體DNA和含量3~4倍于載體的待插入DNA片段,連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl,在12~14℃反應(yīng)12~16h。
 。10)連接反應(yīng)液可置-20℃保存,供轉(zhuǎn)化用。
 
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