1.儀器裝置 包括電泳室及直流電源兩部分。 常用的水平式電泳室裝置如圖,包括兩個(gè)電泳槽A和一個(gè)可以密封的玻璃(或相應(yīng)材料)蓋B;兩側(cè)的電泳槽均用有機(jī)玻璃(或相應(yīng)材料)板C分成兩部分;外格裝有鉑電極(直徑0.5~0.8cm)D;里格為可放濾紙E的有機(jī)玻璃電泳槽架F,此架可從槽中取出;兩側(cè)電泳槽A內(nèi)的鉑電極D經(jīng)隔離導(dǎo)線(xiàn)穿過(guò)槽壁與外接電泳儀電源相連。 電源為具有穩(wěn)壓器的直流電源,常壓電泳一般在100~500V,高壓電泳一般在500~10 000V。
2. 操作
(1) 電泳緩沖液 枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0) 取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g,加水4000ml,使溶解。
(2) 濾紙 取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過(guò)夜,次日取出,用水漂洗至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,備用。可按需要裁成長(zhǎng)27cm、寬18cm的濾紙,或根據(jù)電泳室的大小裁剪,并在距長(zhǎng)度方向一端5~8cm處劃一起始線(xiàn),每隔2.5~3cm處做一記號(hào)備點(diǎn)樣用。
(3) 點(diǎn)樣 有濕點(diǎn)法和干點(diǎn)法。濕點(diǎn)法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中,濕潤(rùn)后,取出,用濾紙吸干多余的緩沖液,置電泳槽架上,使起始線(xiàn)靠近陰極端,將濾紙兩端浸入緩沖液中,然后用微量注射器精密點(diǎn)加供試品溶液,每點(diǎn)10μl,共3點(diǎn),并留2個(gè)空白位置。 干點(diǎn)法是將供試品溶液點(diǎn)于濾紙上,吹干、再點(diǎn),反復(fù)數(shù)次,直至點(diǎn)完規(guī)定量的供試品溶液,然后用噴霧器將濾紙噴濕,點(diǎn)樣處最后噴濕,本法適用于稀的供試品溶液。
(4) 電泳 于電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒(méi)鉑電極,接通電泳儀穩(wěn)壓電源擋,調(diào)整電壓梯度為18~20V/cm,電泳約1小時(shí)45分鐘,取出,立即吹干,置紫外光燈(254nm)下檢視,用鉛筆劃出紫色斑點(diǎn)的位置。
(5) 含量測(cè)定 剪下供試品斑點(diǎn)和與斑點(diǎn)位置面積相近的空白濾紙,剪成細(xì)條,分別置試管中,各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml,搖勻,放置1小時(shí),用3號(hào)垂熔玻璃漏斗濾過(guò),也可用自然沉降或離心法傾取上清液,按各藥品項(xiàng)下的規(guī)定測(cè)定吸收度,并按吸收系數(shù)計(jì)算含量。