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蛋白酶K消化裂解法提取制備模板核酸

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

蛋白酶K消化裂解法適用于所有標(biāo)本的消化處理,尤以DNA樣品為佳.如組 織細(xì)胞(包括石蠟包埋組織)絨毛、毛發(fā)、精斑、血液(血清、血漿、全血)局部分泌 物、尿,糞便等.

1.試劑配制

 、俚鞍酌窴消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
  10mmol/LEDTA
  150mmol/LNaCL
  0.5%SDS
  100~200ug/ml蛋白酶K.
 、诘鞍酌窴最好用水配成20mg/ml,臨用時(shí)加入消化液中.

2.提取方法

  有些標(biāo)本、在用蛋白酶K消化前,還需預(yù)處理一下,如糞便、分泌物、痰液、組 織塊、石蠟包埋組織等,其方法有離心去掉雜質(zhì),脫蠟等.
  臨床標(biāo)本或經(jīng)預(yù)處理的標(biāo)本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混勻,55℃1~3小時(shí), 或37℃過(guò)夜.加等體積的飽和酚抽提1~2次,再加等體積的氯仿:異戊醇(49:1)抽提一 次,上清加入1/10體積的pH值5.23mmol/L醋酸鈉緩沖液,加入2.5倍體積的冰冷無(wú)水 乙醇(或加等體積的異丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000轉(zhuǎn)/min離心15min.小心吸 棄或倒出上清,沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min離心洗滌1~2次,特別小心的 吸棄或倒掉上清,真空或37℃溫箱或室溫干燥,加TE緩沖液20ul.溶解后,取3~8ul 用于PCR擴(kuò)增,或放-20℃保存.
  蛋白酶K消化法除上述經(jīng)典處理法外,亦可在蛋白K消化處理標(biāo)本,經(jīng)離心處理 后,吸取上清經(jīng)95~97℃或煮沸10min滅活蛋白酶K后,直接作核酸模板用于PCR擴(kuò)增. 如雜質(zhì)較多,還可經(jīng)酚:氯仿抽提后,即可用于PCR反應(yīng).此法蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)消除 徹底,Taq酶活性不受影響,具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性.但操作繁復(fù),技術(shù)要求高.


 
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