1 質(zhì)粒DNA的提取
質(zhì)粒DNA是細(xì)菌細(xì)胞中小的共價(jià)閉合環(huán)狀雙鏈DNA。由于基因工程中使用的載體主要是質(zhì)粒，因此，質(zhì)粒DNA的提取和純化是進(jìn)行基因工程的重要前提。提取質(zhì)粒DNA的方法很多，下面介紹幾種有代表性的程序。
1)酚提取法
2)堿提取法 其基本原理是在溶菌酶和SDS破壁釋放DNA后，在強(qiáng)堿條件下，DNA變性成單鏈，當(dāng)加醋酸鈉(NaAc)適當(dāng)中和pH時(shí)，質(zhì)粒DNA復(fù)性；而Ch-DNA和大分子RNA仍為單鏈并與蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物被高鹽沉淀，質(zhì)粒DNA留在溶液中。不需經(jīng)酚氯仿抽提，即可直接用乙醇沉淀上請(qǐng)中的p-DNA)。
3)煮沸提取法 此法快速簡(jiǎn)便，既可小規(guī)模檢驗(yàn)也可大規(guī)模制備質(zhì)粒DNA。其基本原理是在溶菌酶和Triton破壁釋放DNA后，迅速煮沸，使Ch-DNA和蛋白質(zhì)沉淀，質(zhì)粒DNA留在溶液中。
2 質(zhì)粒DNA的純化(PCR產(chǎn)物的純化)
(1)加入0.1倍體積的10×STE緩沖液
⑵ 加入等體積的4 mol/L NH4Ac
⑶ 加入2.5倍體積室溫放置的無(wú)水乙醇
⑷ 立即在室溫下12 000r/min, 離心10 min，使DNA沉淀，小心地去掉上清
⑸ 加入200μl的70%（V/V）乙醇
⑹ 室溫下12 000r/min, 離心10 min，小心地去掉上清，干燥
⑺ 用與原樣品體積相等（或減小體積以使樣品濃縮）的TE緩沖液重懸DNA，放置4℃待用, 或-20℃貯存。