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核酸的沉降特性

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

溶液中的核酸分子在引力場(chǎng)中可以下沉。不同構(gòu)象的核酸(線形,開環(huán),超螺旋結(jié)構(gòu))、蛋白質(zhì)及其他雜質(zhì)在超離心機(jī)的強(qiáng)大引力場(chǎng)中,沉降的速率有很大差異,所以可以用超離心法純化核酸,或?qū)⒉煌瑯?gòu)象的核酸進(jìn)行分離,也可以測(cè)定核酸的沉降常數(shù)與分子量。

應(yīng)用不同介質(zhì)組成密度梯度進(jìn)行超離心分離核酸時(shí),效果較好。RNA分離常用蔗糖梯度。分離DNA時(shí)用得最多的是氯化銫梯度。氯化銫在水中有很大的溶解度。可以制成濃度很高(8mol/L)的溶液。

應(yīng)用啡啶溴紅—氯化銫密度梯度平衡超離心,很容易將不同構(gòu)象的DNA、RNA及蛋白質(zhì)分開。這個(gè)方法是目前實(shí)驗(yàn)室中純化質(zhì)粒DNA時(shí)最常用的方法。如果應(yīng)用垂直轉(zhuǎn)頭,當(dāng)轉(zhuǎn)速為65 000r/min(Beckman L-70超離心機(jī)),只要6h即可以完成分離工作。但是如果采用角轉(zhuǎn)頭,轉(zhuǎn)速為45 000r/min時(shí),則需36h。離心完畢后,離心管中各種成分的分布可以在紫外光照射下顯示得一清二楚。蛋白質(zhì)漂浮在最上面,RNA沉淀在底部。超螺旋DNA沉降較快,開環(huán)及線形DNA沉降較慢。用注射針頭從離心管側(cè)面在超螺旋DNA區(qū)帶部位刺入,收集這一區(qū)帶的DNA。用異戊醇抽提收集到的DNA以除去染料,然后透析除CsCl,再用苯酚抽提1~2次,即可用乙醇將DNA沉淀出來。這樣得到的DNA有很高的純度, 可供DNA重組、測(cè)定序列及繪制限制酶圖譜等。在少數(shù)情況下,需要特別純的DNA時(shí),可以將此DNA樣品再進(jìn)行一次氯化銫密度梯度超離心分離。

 

 
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