對于一些實驗室來說，如果現(xiàn)成的商品化芯片不能滿足研究需要，而自行設(shè)計向廠家定做芯片也不能滿足時間的需要時，就需要自制芯片。要成功的制作芯片，需要準備3大材料：準備固定在芯片上的生物分子樣品、芯片片基和的制作芯片的儀器。研究目的不同，期望制作的芯片類型不同，制備芯片方法也不盡相同，以DNA芯片為例，基本上可分為兩大類：一類是原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探針），適用于寡核苷酸；一類是預(yù)合成后直接點樣多用于大片段DNA，有時也用于寡核苷酸，甚至mRNA。
原位合成有兩種途徑，一是原位光刻合成（Affymerix公司專利技術(shù)，參見前文介紹），該方法的主要優(yōu)點是可以用很少的步驟合成極其大量的探針陣列。某一含N個核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×N個化學步驟能合成出4N個可能結(jié)構(gòu)。例如合成想要8核苷酸探針，通過32個化學步驟，8個小時可合成65，536個探針。而如果用傳統(tǒng)方法合成然后點樣，那么工作量的巨大將是不可思議的。同時，用該方法合成的探針陣列密度可高達到106/cm2。
另一種原位合成是壓電打印法(Piezoelectric printing)。原理與普通的彩色噴墨打印機相似，所用技術(shù)也是常規(guī)的固相合成方法。不過芯片噴印頭和墨盒有多個，墨盒中裝的是四種堿基合成試劑。噴印頭可在整個芯片上移動。支持物經(jīng)過包被后，根據(jù)芯片上不同位點探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。沖洗、去保護、偶聯(lián)等則同于一般的固相合成技術(shù)。該技術(shù)采用的化學原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制定備的化學試劑。每步產(chǎn)率可達到99%以上，可以合成出長度為40到50個堿基的探針。
盡管如此，原位合成方法仍然比較復(fù)雜，除了在基因芯片研究方面享有盛譽的Affymetrix等公司使用該技術(shù)合成探針外，其它中小型公司大多使用合成點樣法。
點樣法是將預(yù)先通過液相化學合成好的探針、或PCR技術(shù)擴增cDNA或基因組DNA經(jīng)純化、定量分析后，通過由陣列復(fù)制器（arraying and replicating device ARD）或陣列點樣機（arrayer）及電腦控制的機器人，準確、快速地將不同探針樣品定量點樣于帶正電荷的尼龍膜或硅片等相應(yīng)位置上（支持物應(yīng)事先進行特定處理，例如包被以帶正電荷的多聚賴酸或氨基硅烷），再由紫外線交聯(lián)固定后即得到DNA微陣列或芯片。點樣的方式分兩種，其一為接觸式點樣，即點樣針直接與固相支持物表面接觸，將DNA樣品留在固相支持物上；其二為非接觸式點樣，即噴點，它是以壓電原理將DNA樣品通過毛細管直接噴至固相支持物表面。打印法的優(yōu)點是探針密度高，通常1平方厘米可打印2,500個探針；缺點是定量準確性及重現(xiàn)性不好，打印針易堵塞且使用壽命有限。噴印法的優(yōu)點是定量準確，重現(xiàn)性好，使用壽命長；缺點是噴印的斑點大，因此探針密度低，通常只有1平方厘米400點。點樣機器人有一套計算機控制三維移動裝置、多個打印/噴印頭、一個減震底座，上面可放內(nèi)盛探針的多孔板和多個芯片。根據(jù)需要還可以有溫度和濕度控制裝置、針洗滌裝置。打印/噴印針將探針從多孔板取出直接打印或噴印于芯片上。檢驗點樣儀是否優(yōu)秀的指標包括點樣精度、點樣速度、一次點樣的芯片容量、樣點的均一性、樣品是否有交叉污染及設(shè)備操作的靈活性、簡便性等等。
一、點樣設(shè)備
Telechem公司全新SpotBot Personal Microarrayer
對于那些需要經(jīng)常小批量使用多種不同的研究用芯片的普通用戶來說，向Affymetrix這樣的大公司定做自行設(shè)計芯片的時間和成本太高，然而又不太可能支付得起一套高性能的大型生物芯片點樣制作系統(tǒng)，Telechem公司最新推出的SpotBot個人微陣列點樣機絕對是一個好消息。這種只有一臺臺式普通離心機大小(30cm x 30cm x 22cm)的個人芯片點樣機功能相當完備：
4針的打印頭(4-Pin Printhead)可以配各種Stealth點樣針；
一次可以放置14張玻片(25mm x76mm/片)；每張片可以點3600個點(9mm x9mm區(qū)域)；
最大的打印范圍可達20mm x 70mm；將來軟件升級后每張片將可以打50400個點；
點樣可以選擇每個樣品單點、雙點或者3點；
可以放置1塊384孔板，可以手工換板；
完成一塊384孔板的點樣時間為2小時(每個樣品3點，14張玻片)，6小時可在14張玻片上點超過1000個樣品(雙點/樣品)；
先進的自動清洗干燥臺保證樣品之間沒有交叉污染；
透明罩保證點樣工作環(huán)境的清潔和恒定的溫度和濕度；
開關(guān)門感應(yīng)器保證用戶的安全；
軸運動偏差±10μm；
外形輕巧可愛，連真空泵和蠕動泵在內(nèi)總重僅6.4公斤，
最令人驚喜的是價格相當便宜！
美國Cartesian Technology公司的MicroSys 5100小型臺式芯片工作站MicroSys 5100也是專門為實驗室做小量芯片研究工作設(shè)計的一套臺式工作站。一次處理10張芯片，采用接觸式點樣技術(shù)，使用標準的CHipMaker或Stealth點樣針，可放置1塊96/384孔樣品板，并配有一套載片真空固定系統(tǒng)和一套針頭清洗真空干燥系統(tǒng)。價格低廉，非常適合經(jīng)費緊缺的研究部門做芯片應(yīng)用的中小型研究項目使用。
對于中型到大型的用戶則可以選擇美國Cartesian Technology公司PA系列、SQ系列生物芯片點樣制作系統(tǒng)。這家公司在芯片技術(shù)剛出現(xiàn)時就致力于開發(fā)能將生物芯片變?yōu)楝F(xiàn)實的點樣制作系統(tǒng)，并得到生物芯片技術(shù)的開創(chuàng)者M.Schena的支持。通過與著名的點樣針制作廠家TeleChem公司聯(lián)合，融合自身擁有多項專利的噴點技術(shù)，生產(chǎn)的芯片點樣系統(tǒng)一直在該領(lǐng)域獨占鰲頭。
PA系列是應(yīng)用專利的 PinArrayTM （針陣列）技術(shù)，在玻片等基質(zhì)上生產(chǎn)高密度芯片的生物芯片點樣系統(tǒng)，該系列的產(chǎn)品均使用TeleChem公司的 ChipMaker 和 Stealth 系列點樣針。點陣密度可以達到2500/cm2
PixSys 5500 PA Workstation.
適用于中等工作量研究用途的點樣工作站。該系列配備精密的Telechem點樣針，也可同時選配synQUAD微定量噴頭，點樣快速、精確，適用范圍廣泛，使目前生物芯片點樣系統(tǒng)的主流產(chǎn)品。
ProSys 5510 PA Workstation.
應(yīng)用其專利的PinArrayTM 技術(shù)在玻璃片基上生產(chǎn)高密度芯片的高通量點樣工作站。適用范圍廣，點樣快速精確，自動化程度高，一次可處理100張芯片，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)使用。
SQ系列生物芯片點樣系統(tǒng)
SQ系列使應(yīng)用其專利的synQUADTM 技術(shù)在各種類型的膜及玻片等基質(zhì)上進行非接觸的同步噴點系統(tǒng)，還可以用來進行轉(zhuǎn)板等微定量液體轉(zhuǎn)移工作。點樣速度可達1000點/分鐘。
二、芯片片基
用點樣法制作芯片，除了專用的儀器外，還需要要選擇合適的固相支持物--芯片片基，也就是載體材料。一般來說各種芯片片基都選擇經(jīng)過相應(yīng)處理的硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等作為支持物。作原位合成的支持物在聚合反應(yīng)前要先使其表面衍生出羥基或氨基（視所要固定的分子為核酸或寡肽而定）并與保護基建立共價連接；作點樣用的支持物為使其表面帶上正電荷以吸附帶負電荷的探針分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚賴氨酸等。我們在下面介紹一些常見的相關(guān)產(chǎn)品：
膜：與玻片相比，膜的優(yōu)點是與核酸親和力強，雜交技術(shù)成熟，通常無需另外包被。由于尼龍膜與核酸的結(jié)合能力、韌性、強度都比較理想，以膜為基質(zhì)的芯片絕大多數(shù)采用尼龍膜。Schleicher & Schuell 公司是專業(yè)生產(chǎn)雜交/過濾膜的公司，著名的硝酸纖維素膜即是該公司首家推出的。S&S的Nytran SuPer Charge正電荷尼龍膜帶電量是常規(guī)正電荷尼龍膜的3倍，與核酸的結(jié)合力更強，而且又大大降低了背景和非特異結(jié)合，克服背景高的缺點，加上韌性強，反復(fù)雜交10次依然保持表面平整的優(yōu)點，成為制作尼龍膜芯片的最佳選擇。Nytran SuPerCharge有多種規(guī)格，詳細資料可以向基因有限公司查詢。
玻片：用于制作芯片的玻片必須特別清潔和平滑。玻片表面必須包被合適的功能基團能將靶DNA片段固定住并防止其在雜交洗滌過程中被沖洗掉。經(jīng)表面化學處理的玻片是一種持久的載體，它可耐受高溫和高離子強度；玻片具有不浸潤性，使雜交體積降低到最小，因此提高了退火時的動力學參數(shù)，疏水表面可以使點密度大于親水表面（因為親水表面上樣品點將擴散）；玻片的熒光信號本底低，不會造成很強的背景干擾；玻璃芯片可使用雙熒光甚至多熒光雜交系統(tǒng)，可在一個反應(yīng)中同時對兩個以上的樣本進行平行處理。由上可知，以玻璃為載體的芯片更具有發(fā)展和應(yīng)用的前景。
S&S公司的CAST Slides(Cat.No.10484181,20/box)將SuPerCharge正電荷尼龍膜附著在玻片上，這種特殊的玻片綜合了尼龍膜的高親和力和玻片剛性的優(yōu)點，是世界上第一個膜結(jié)合玻片。而FAST Slides (Cat.No.10484182,20/box)則是在玻片表面包被一種專利的聚合物，這種聚合物能迅速與DNA以非共價但是不可逆的方式結(jié)合。由于表面包被層的多孔性和厚度使單位面積的DNA結(jié)合能力比常規(guī)化學表面處理玻片要高得多，使得檢測更加靈敏。其雜交方式和傳統(tǒng)的雜交一樣。適用的檢測方法包括同位素檢測、化學發(fā)光法和熒光檢測--由于包被的多聚物有效降低對入射光的散射，F(xiàn)AST Slide同樣適合用激光共聚焦成像系統(tǒng)進行熒光檢測。
TeleChem ArrayIt Super Microarray Substrates(25mm x 76mm)采用高清潔度，超平表面的的玻片并進行化學修飾，各項技術(shù)指標居同類產(chǎn)品前列。SuperClean(Cat.No.SMC-25, etc.)， SuperAmine (Cat.No.SMM-25,etc.)和SuperAldehyd(Cat.No.SMA-25, etc.)三種規(guī)格可偶聯(lián)核酸、蛋白、甚至細胞，且偶聯(lián)過程可以在室溫及中性條件下進行。
Clontech提供的DNA-Ready Type I Slides (Cat.No.7880-1, 5 slides/box)是氨基修飾的，能結(jié)合200bp-10kb的修飾和未經(jīng)修飾的DNA，DNA-Ready Type II Slides (Cat.No.7881-1, 5 slides/box)是特殊氨基修飾的，能結(jié)合50bp-10kb的修飾和未經(jīng)修飾的DNA。
另外CEL公司也提供醛基化修飾的玻片Silylated Slides(Cat.No.CSS-25)。
三、點樣樣品
點樣樣品的制備是非常關(guān)鍵的一步。樣品的純度、雜交特異性直接決定自制芯片的質(zhì)量和可信度�？梢哉f，沒有好的樣品，自制芯片也就沒有多大意義。
我們在前面介紹了Clontech公司的Atlas系列，其中Glass Array和Plastic Array上那8300個基因?qū)?yīng)的80堿基長寡核苷酸序列是經(jīng)過Clontech公司專利軟件在GenBank中篩選出的同源性最低，又經(jīng)Clontech實驗確保能給出很強雜交信號的片斷。這種精巧的設(shè)計保證很高的分辨率、靈敏度，實在令人印象深刻�，F(xiàn)在，你可以通過基因公司定購這些寡核苷酸來制作自己的芯片了。足夠點1000次芯片的8327個人類基因、5002個小鼠基因或者將近4000個大鼠基因的寡核苷酸片斷（凍干）放在96孔板中，連同100個Type II玻片和雜交盒，200ml雜交液，全面滿足中小型實驗項目的需求。這些寡核苷酸序列數(shù)目齊全，質(zhì)量可靠，能為自制芯片的靈敏度和分辨率提供可靠的保證，也避免了合成8000多基因的麻煩。還有更大包裝可供選擇。對Atlas Nylon Array上的200-600bp的cDNA片斷感興趣的研究人員則可以選擇Ready-to-Print cDNA 系列，共計5278個人類基因，3197個小鼠基因或者2727個大鼠基因（每個基因片斷有3ug，分裝在96孔板中），均可定購。
如果人、小鼠和大鼠的這些Oligo還不能滿足你的需要，那么可以選擇Operon公司的Array-Ready Oligo Sets。剛被QIAGEN公司收購的Operon公司是世界著名的DNA合成專家，提供包括有酵母基因組、人類基因組、小鼠基因組、瘧原蟲基因組和肺結(jié)核桿菌基因組的Oligo sets。所有的OligoSets都是按最新的數(shù)據(jù)而設(shè)計的。由于測序速度的提升，更多新數(shù)據(jù)涌現(xiàn)，Operon公司保證以后根據(jù)新數(shù)據(jù)設(shè)計的Oligos將以升級試劑盒的形式提供。
Yeast Genome Oligo Set里提供斯坦福大學酵母基因組數(shù)據(jù)庫（SGD）中6307個釀酒酵母的開放閱讀框中挑選的長度為70-mer單鏈寡核苷酸和10個對照，所有的序列經(jīng)過BLAST保證同源性最低，避免非特異雜交。每種Oligo有2000pmol，足夠點2000-6000張片。
Alaria Genome Oligo Set則包含整個Plasmodium falciparum瘧原蟲基因組6231個預(yù)測的基因或ORF對應(yīng)的70-mer寡核苷酸，以及138個對照，是由加州大學的芯片專家Dr.Joe DeRisi協(xié)助設(shè)計的。數(shù)據(jù)來源是Sanger中心和TIGR以及斯坦福大學。
Operon公司也提供Human Genome Oligo Set，包含13971個來源于UniGene中的已知基因?qū)?yīng)的70-mer寡核苷酸序列（Hs build 119）和29個對照。（The UniGene database automatically clusters all human Genbank sequences into a non-redundant set of genes. Similar databases are also available for the rat and mouse genomes. Each cluster in the UniGene database represents one unique gene. A cluster may contain many sequences, but one representative sequence has been selected based on the longest region of high-quality sequence data.）
Mouse Genome Oligo Set同樣包含6868個已知基因?qū)?yīng)的70-mer序列，數(shù)據(jù)來源也是Mouse UniGene Build 83，還有16個對照。每個Oligo的量也是2000pmol。
Tuberculosis Genome Oligo Set包含4295個70-mer Oligo，其中大部分是來源于Sanger中心測序的Mycobacterium tuberculosis H37RV (lab strain)基因組中預(yù)測的3924個基因，另外371個是來源于TIGR（The Institute for Genomic Research）測序的TB strain CDC-1551中和前者同源性低于97%的預(yù)測基因。
除了購買現(xiàn)成的核酸，還可以通過自己合成寡核苷酸和PCR擴增模板的方法制備點樣樣品。由于自己合成Oligo成本太高，只適于少量特殊樣品。最常用的還是PCR擴增。一張芯片上可不只10個8個樣本，少則上百多則上千個樣本的質(zhì)粒純化、PCR以及PCR產(chǎn)物純化，加上芯片上的樣品量很有限，點樣的純度必須有保證，所以QIAGEN公司的96孔高通量核酸純化系列是最好的選擇。一次可以純化96個樣品，大大簡化了上百個樣本純化的工作量和操作強度。
26171 R.E.A.L. Prep 96 Plasmid Kit(4x96)——高通量堿法純化小量質(zhì)粒DNA，只需60-75分鐘即可純化96個樣品，需要96孔板離心機。
27191 QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(4x96)——高通量堿法純化小量質(zhì)粒DNA，采用真空抽濾的方法，只需45分鐘即可純化96個樣品，無需96孔板離心機。質(zhì)粒純度高。
27781 QIAprep 96 M13 Kit(4x96——高通量純化M13單鏈DNA，采用真空抽濾的方法，只需45分鐘即可純化96個樣品。
28181 QIAquick 96 PCR Purification Kit--采用真空抽濾的方法，利用硅膠膜技術(shù)25分鐘內(nèi)從PCR反應(yīng)體系中回收高純度的DNA，回收率高達90%(100bp-10kb)，可除掉 99.5 %的引物，無需另外去除石蠟油，無需乙醇沉淀，無需酚、氯仿等有機試劑。純化產(chǎn)物可直接用于芯片點樣或測序。
Telechem 公司：世界著名的芯片供應(yīng)商，提供各種芯片方面的耗材和試劑。其PCR產(chǎn)物純化試劑盒利用高級濾膜技術(shù)，具有價格低、通量高、速度快等優(yōu)點。無需乙醇沉淀，無需酚、氯仿等有機試劑。90%以上的回收率，99.9%的DNA純度，孔與孔之間的交叉污染小于0.01%，每天可以純化1000個以上的樣品。
大規(guī)模樣品純化
對于較大規(guī)模制作芯片的用戶，由于點樣樣品數(shù)目太多，即使采用這種高通量試劑盒還是不夠方便。這時不妨考慮分子生物學的標準工作站--全自動核酸和蛋白純化工作站。這可不同于那種單一樣品大量純化的系統(tǒng)，而是特別適合芯片制作的很多個樣品小量純化系統(tǒng)。
隨著人類基因組、功能組的研究不斷深入，生物芯片的研究在全世界開展的如火如荼，它已經(jīng)成為進行大規(guī)模分子生物學研究的有利工具。但是在芯片飛速發(fā)展的今天，樣品制備已經(jīng)成為芯片發(fā)展的瓶頸所在。生物樣品往往是各種組分的混合體，成分非常復(fù)雜，傳統(tǒng)的核酸和蛋白純化方法需要花費大量的人力、物力、財力，而且許多有機試劑會對人體造成不同的傷害。如今，您再也不用為紛繁復(fù)雜的純化過程而煩惱了，世界上聲譽卓著的核酸純化供應(yīng)商--QIAGEN公司推出了全自動核酸和蛋白純化工作站--4個不同的自動純化系統(tǒng)型號：BioRobot 8000，BioRobot 3000，BioRobot 9604，BioRobot 9600，加上QIAGEN優(yōu)質(zhì)的多種配套純化試劑盒--從質(zhì)粒、粘粒、RNA、血液基因組DNA、病毒DNA到蛋白，品種豐富，信譽卓著，帶著德國人的嚴謹和自信，在歐美的生物醫(yī)學市場上掀起了一場革命，各大分子生物學中心、芯片中心、醫(yī)學中心爭相搶購。作為國內(nèi)最大的生命科學領(lǐng)域內(nèi)的儀器和試劑供應(yīng)商，我們有理由，更有責任將這套系統(tǒng)推薦給在生命科學領(lǐng)域內(nèi)忘我工作的科學家，為大家分憂解難，為促進中國的生物芯片產(chǎn)業(yè)發(fā)展盡牽線搭橋，為縮小與歐美在生命科學領(lǐng)域內(nèi)的差距盡一份薄力。
BioRobot 8000:
專為基因組實驗室設(shè)計，同時也可以用于其他分子生物學領(lǐng)域。高通量、快速、全自動核酸純化系統(tǒng)，功能強大的真空過柱、振蕩混勻及加熱制冷裝置，無需離心即可進行核酸純化。8通道自動移液系統(tǒng)可以對384孔板進行準確、快速地移液處理。
特點：
1、高通量核酸純化。
2、速度快、全自動樣品傳送及液面監(jiān)控。
3、高精確處理384孔板。
4、提供優(yōu)質(zhì)配套試劑，結(jié)果重復(fù)性好。
5、具有功能強大的軟件處理系統(tǒng)。
6、提供配套的優(yōu)質(zhì)試劑
BioRobot 3000:
此系列為可根據(jù)客戶的不同需求量身定做的分子生物學平臺。自動移液，軟件功能強大，用途廣泛。主要可以應(yīng)用于：基因組或質(zhì)粒DNA，RNA純化病毒DNA，RNA純化，6×His蛋白純化，PCR產(chǎn)物純化，PCR、測序及其它反應(yīng)體系準備，Re-arraying。
特點：
1、根據(jù)客戶的不同需求量身定做
2、靈活的操作系統(tǒng)、滿意的結(jié)果
3、準確的槍頭定位系統(tǒng)（根據(jù)液面不同）和液體傳輸系統(tǒng)
4、可選擇與其他儀器（如分光光度計）連用的自動機械臂
5、自動的樣品跟蹤和過程控制系統(tǒng)（條形碼掃描）
6、簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
7、提供配套的優(yōu)質(zhì)試劑
BioRobot 9604；
此儀器是專為臨床樣品和細胞培養(yǎng)液設(shè)計的核酸自動純化的分子生物學工作站�？勺詣訌呐R床診斷樣品（各種血樣，體液，口腔刮離細胞及細胞培養(yǎng)物等）中純化基因組DNA、質(zhì)粒DNA、RNA、病毒DNA及RNA，還可進行PCR產(chǎn)物純化，PCR樣品準備。適用于 醫(yī)院，檢驗科分子診斷，血庫，檢疫，海關(guān)病毒檢測，血液分型，法醫(yī)DNA指紋鑒定制藥公司藥物篩選等。
特點：
滿足分子診斷所需DNA的標準的、自動純化操作過程
滿意的得率和可信的結(jié)果
自動的樣品跟蹤和過程控制系統(tǒng)（條形碼掃描）
可同時進行2X96樣品，且有很好的可重復(fù)性
可安全處理有傳染性的樣品
配套的高質(zhì)量試劑
簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
BioRobot9600：
此儀器是為常規(guī)分子生物學研究設(shè)計的核酸純化工作站�？梢赃M行質(zhì)粒DNA，RNA純化病毒DNA，RNA純化， PCR產(chǎn)物純化，PCR、測序及其它反應(yīng)體系準備，Re-arraying。
特點：
分子生物學標準的、自動核酸純化操作過程
移液過程中不會造成交叉污染
配套的高質(zhì)量試劑
簡單易學的軟件操作系統(tǒng)
