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物理圖譜

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-09-19
? 物理圖譜是利用限制性內(nèi)切酶將染色體切成片段,再根據(jù)重疊序列確定片段間連接順序,以及遺傳標(biāo)志之間物理距離[堿基對(duì)(bp) 或千堿基(kb)或兆堿基(Mb)]的圖譜。以人類基因組物理圖譜為例,它包括兩層含義,一是獲得分布于整個(gè)基因組30 000個(gè)序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS,其定義是染色體定位明確且可用PCR擴(kuò)增的單拷貝序列)。將獲得的目的基因的cDNA克隆,進(jìn)行測(cè)序,確定兩端的cDNA序列,約200bp,設(shè)計(jì)合成引物,并分別利用cDNA和基因組DNA作模板擴(kuò)增;比較并純化特異帶;利用STS制備放射性探針與基因組進(jìn)行原位雜交,使每隔100kb就有一個(gè)標(biāo)志;二是在此基礎(chǔ)上構(gòu)建覆蓋每條染色體的大片段:首先是構(gòu)建數(shù)百kb的YAC(酵母人工染色體),對(duì)YAC進(jìn)行作圖,得到重疊的YAC連續(xù)克隆系,被稱為低精度物理作圖,然后在幾十個(gè)kb的DNA片段水平上進(jìn)行,將YAC隨機(jī)切割后裝入粘粒的作圖稱為高精度物理作圖.

  因限制性內(nèi)切酶在DNA鏈上的切口是以特異序列為基礎(chǔ)的,核苷酸序列不同的DNA,經(jīng)酶切后就會(huì)產(chǎn)生不同長度的DNA片段,由此而構(gòu)成獨(dú)特的酶切圖譜。因此,DNA物理圖譜是DNA分子結(jié)構(gòu)的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶產(chǎn)生的用于測(cè)序反應(yīng)的DNA片段只是其中的極小部分,這些片段在DNA鏈中所處的位置關(guān)系是應(yīng)該首先解決的問題,故DNA物理圖譜是順序測(cè)定的基礎(chǔ),也可理解為指導(dǎo)DNA測(cè)序的藍(lán)圖。廣義地說,DNA測(cè)序從物理圖譜制作開始,它是測(cè)序工作的第一步。制作DNA物理圖譜的方法有多種,這里選擇一種常用的簡便方法──標(biāo)記片段的部分酶解法,來說明圖譜制作原理。

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用部分酶解法測(cè)定DNA物理圖譜包括兩個(gè)基本步驟:

  (1)完全降解:選擇合適的限制性內(nèi)切酶將待測(cè)DNA鏈(已經(jīng)標(biāo)記放射性同位素)完全降解,降解產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離后進(jìn)行自顯影,獲得的圖譜即為組成該DNA鏈的酶切片段的數(shù)目和大小。

  (2)部分降解:以末端標(biāo)記使待測(cè)DNA的一條鏈帶上示蹤同位素,然后用上述相同酶部分降解該DNA鏈,即通過控制反應(yīng)條件使DNA鏈上該酶的切口隨機(jī)斷裂,而避免所有切口斷裂的完全降解發(fā)生。部分酶解產(chǎn)物同樣進(jìn)行電泳分離及自顯影。比較上述二步的自顯影圖譜,根據(jù)片段大小及彼此間的差異即可排出酶切片段在DNA鏈上的位置。下面是測(cè)定某組蛋白基因DNA物理圖譜的詳細(xì)說明。

  該基因全長5900bp,用限制酶HpaⅡ完全降解該DNA可產(chǎn)生五個(gè)大小不等的片段,電泳分離并參照已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA帶,得知這些片段的大小分別為1930、1690、1020、950和310bp。不難推測(cè)該DNA上有四個(gè)HpaⅡ切口,但切口的位置和這五個(gè)片段在完整基因中的排列順序此時(shí)尚無法知道。接著將末端標(biāo)記的該DNA片段進(jìn)行HpaⅡ的部分降解,由于各切口隨機(jī)斷裂,產(chǎn)生的片段數(shù)顯然會(huì)多于完全降解產(chǎn)物。但電泳后的自顯影圖上只可能出現(xiàn)末端標(biāo)記的DNA片段。若以待測(cè)DNA在左端為標(biāo)記處,那么自顯影圖上將呈現(xiàn)4210、3260、2950和1020bp四條帶。其中最小片段(1020bp)與完全降解產(chǎn)物為同一片段,它應(yīng)定位于該基因的左端;而最大片段(4210bp)與完整基因(5900bp)之差的片段(1690bp)無疑應(yīng)定位于該基因的右端;余下的三個(gè)片段(1930、930和310bp)的定位,根據(jù)部分酶解的相鄰片段之差很易確定。據(jù)此推出的這五個(gè)片段在該基因上的排列順序是(左→右):1020-1930-310-950-1690。物理圖譜與DNA測(cè)序的原理頗為相似,二者是通過片段長度來推測(cè)位置,所不同的是測(cè)序確定核苷酸(堿基)的位置,而此處是確定某個(gè)片段的位置。DNA物理圖譜測(cè)定后,便可對(duì)每一酶切片段進(jìn)行核苷酸順序分析。在測(cè)定了所有片段的DNA順序后,根據(jù)物理圖譜將各片段"拼湊"起來就得出了待測(cè)DNA鏈的全部核苷酸順序。基因的全順序測(cè)定才是我們要達(dá)到目的,一般人類基因的長度都在10Kb以上,巨大基因可長達(dá)200Kb,要完成基因的全順序測(cè)定需進(jìn)行大量的工作。完成這些工作可采取多種不同的方法,但其基本思路是一致的,即在確定物理圖譜的基礎(chǔ)上,再進(jìn)行DNA順序測(cè)定。

 

 
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