1 原位在線檢測(cè)的技術(shù)

1.1 紅外光譜技術(shù)

很多物質(zhì)對(duì)紅外線都有一定的吸收能力，且不同物質(zhì)有不同特征吸收波段。紅外線被吸收的數(shù)量與吸收介質(zhì)的濃度有關(guān)，當(dāng)其通過待測(cè)介質(zhì)后，其強(qiáng)度按指數(shù)規(guī)律減弱，符合朗伯-比爾定律。將光源的連續(xù)譜輻射全部投射到被測(cè)樣品上，根據(jù)樣品吸收輻射能的情況來判定被測(cè)成分的含量，目前在工業(yè)連續(xù)分析中應(yīng)用較多。一直以來，原位過程監(jiān)測(cè)中紅外光的傳遞和高性能紅外探頭的研制是難以解決的問題。近幾年通過研究取得了巨大的突破，如借助光路系統(tǒng)或光導(dǎo)纖維來傳遞紅外光，利用衰減全反射(ATR)原理，采用多次反射復(fù)合金剛石、鋯等材料制做的紅外探頭[1]，可適用于包括水溶液或其它強(qiáng)紅外吸收溶劑、固體粉末或紅外強(qiáng)吸收的樣品，紅外光進(jìn)入樣品的光程恒定，樣品只要與全反射晶體材料緊密貼合即可。1992年，Kun Yu等[2]用在線ATR探頭跟蹤了蔗糖水解、大腸桿菌發(fā)酵等過程，從蔗糖水解過程的紅外譜圖的變化，可清楚地看到蔗糖吸收峰的吸光度下降，葡萄糖和果糖吸收峰的吸光度增加，亦能判斷完全水解所需要的時(shí)間，顯示出ATR/FTIR用于在線控制過程的優(yōu)勢(shì)。

1.2 熒光檢測(cè)技術(shù)

熒光檢測(cè)可分為酶鍵合標(biāo)記法、直接熒光測(cè)量法、熒光試劑測(cè)量法[3]。

酶鍵合標(biāo)記法采用專一性強(qiáng)的鍵合劑，根據(jù)標(biāo)記與非標(biāo)記物在鍵合中心的競爭性反應(yīng)，測(cè)定由鍵合劑置換下來的溶液含量，由此測(cè)知代謝中間物或基質(zhì)的含量。當(dāng)采用熒光標(biāo)記物時(shí)，就可以用熒光分析法進(jìn)行測(cè)定。此種測(cè)定法多用光導(dǎo)纖維探頭。二股光導(dǎo)纖維中的一股用來傳輸激發(fā)用的紫外光，另一股用來接收并傳輸測(cè)定室內(nèi)(含有熒光標(biāo)記物、待測(cè)物及被固定于光纖表面的鍵合劑)激發(fā)出的熒光，熒光經(jīng)濾光片后由光敏器件接收，根據(jù)光強(qiáng)即可測(cè)知待測(cè)液中代謝物的濃度。

直接熒光測(cè)量法適用于測(cè)量自身能夠受激發(fā)發(fā)生熒光的物質(zhì)，可不加試劑直接在激發(fā)光照射下進(jìn)行比色，由于一定的熒光物質(zhì)只能吸收一定頻率的光，而且能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)發(fā)出的熒光波長也不盡相同，因而只要控制激發(fā)光和熒光單色器的波長，便可得到好的選擇性結(jié)果，儀器安裝在培養(yǎng)液面下的反應(yīng)器視鏡上，激發(fā)光源經(jīng)濾色片照射到培養(yǎng)液上，待測(cè)物產(chǎn)生熒光，熒光強(qiáng)度由光電倍增管測(cè)量，反射的激發(fā)光及其它波長的熒光在通過濾色片時(shí)被濾去。

熒光試劑測(cè)量法適用于不能直接受激發(fā)出熒光，但具有與熒光素/熒光素酶產(chǎn)生光發(fā)射特征的物質(zhì)。Lasko等[4]將 cDNA(控制熒光素酶合成)插入大腸桿菌的基因中，使其能合成熒光素酶。當(dāng)往培養(yǎng)基中加入熒光素時(shí)，胞內(nèi)ATP與熒光素在熒光素酶的催化下發(fā)生反應(yīng)，并產(chǎn)生熒光。因熒光強(qiáng)度與ATP濃度有關(guān)，所以經(jīng)驗(yàn)檢測(cè)熒光可知ATP濃度。

1.3 離子敏場效應(yīng)晶體管傳感技術(shù)

是利用胱用舾斜∧せ蟶?锘钚怨δ苣ご?娼鶚艄鉤傻男灤陀性窗氳繼寤??舾釁骷?Ｋ?肫脹ǖ某⌒Ь?騫艿牟煌??υ謨誶罷咼揮薪鶚粽さ緙??ぜ?櫓事懵痘蛟諂潯礱嬪細(xì)哺嵌圓煌?胱用舾械哪ぁ５苯?骷?糜詿?餿芤褐惺保?そ櫓?或離子敏感膜)直接與待測(cè)溶液接觸。傳感器對(duì)離子活度的響應(yīng)可由柵介質(zhì)與電解液界面處的電化學(xué)勢(shì)對(duì)閾電壓的影響來說明: VT=C S×lgai。式中VT為閾電壓，C為常數(shù)，S為離子敏場效應(yīng)晶體管的靈敏度，ai為待測(cè)離子的活度。當(dāng)參比電極及晶體管的其它參數(shù)恒定時(shí)，則閾值電壓與待測(cè)離子活度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。

2 非原位在線檢測(cè)技術(shù)

生化過程的測(cè)控通常要求不能污染被測(cè)系統(tǒng)，許多傳感技術(shù)由于不符合此條件或者其他方面的原因而不能用于原位監(jiān)測(cè)，因此需要把發(fā)酵液樣品連續(xù)自動(dòng)地從發(fā)酵罐中取出，然后對(duì)樣品進(jìn)行自動(dòng)分析。目前所有取樣技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的是流動(dòng)注射分析技術(shù)(FlA)，因其消耗樣品量極少且可與多種檢測(cè)方法相結(jié)合運(yùn)用[5]。有時(shí)為了選擇性地從物系內(nèi)取樣分析，常在取樣品上設(shè)置連續(xù)過濾或滲析裝置，如硅管探頭允許分子在培養(yǎng)液中進(jìn)行選擇性擴(kuò)散，因而可以在反應(yīng)器外分析物質(zhì)的組成。取樣后對(duì)樣品進(jìn)行分析的方法有很多，以下為一些比較新穎的檢測(cè)方法。

2.1 生物傳感器

生物傳感器利用微生物、酶等活性物質(zhì)將待測(cè)物轉(zhuǎn)化為能被已有成熟的傳感器所感知的物質(zhì)再進(jìn)行檢測(cè)。常用的生物傳感器主要有酶電極和微生物電極。

酶電極是將酶與電化學(xué)傳感器相連結(jié)用來測(cè)量底物濃度的電極，是當(dāng)待測(cè)物與酶膜發(fā)生作用時(shí)所產(chǎn)生的物質(zhì)能被電化學(xué)傳感器檢知，從而可通過待測(cè)物與轉(zhuǎn)化物質(zhì)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系推定待測(cè)物質(zhì)的濃度。葉幫策等[6]利用谷氨酸氧化酶共價(jià)偶聯(lián)于硅烷化鉑絲表面構(gòu)建一種簡單的微酶電極，應(yīng)用于流動(dòng)注射分析系統(tǒng)來測(cè)量谷氨酸含量，測(cè)量范圍0~2×10-3mol/L，響應(yīng)時(shí)間小于60s。另外，除了將酶與電化學(xué)傳感器相結(jié)合外，還可將其與其他的分析方法聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)。如周宜開等[7]提出用固定化酶-化學(xué)發(fā)光分析法測(cè)定葡萄糖并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建一種新型葡萄糖傳感器(由固定化酶膜、光敏二極管及醋酸纖維濾膜構(gòu)成)，檢測(cè)下限為0.5

ppm，可連續(xù)測(cè)定200個(gè)樣品。

微生物電極與酶電極原理基本相同，只不過將酶膜換成微生物即可。王永祥等[8]將大腸桿菌215用吸附法固定于醋酸纖維素膜上，與氧電極配合組成微生物電極，建立了對(duì)維生素Bl2的快速測(cè)定系統(tǒng)，測(cè)定濃度范圍5×10-5--2.5×10-6mg/ml,測(cè)定-個(gè)樣品所需時(shí)間為2h。

除了以上所提到的，近年來又經(jīng)研究設(shè)計(jì)了一種壓電生物傳感器，是把生物敏感元件固定在石英林晶體上所組成的一種新型生物傳感器[9]。當(dāng)一層外來物沉積于雙面鍍金AT切型石英晶體表面時(shí)，晶體的表面質(zhì)量增加，從而引起諧振頻率的變化，它們之間的變化關(guān)系(壓電質(zhì)量傳感的理論基礎(chǔ))為Sauerbrey方程: ΔF/=-2.26×lO-6F2Δm/A。式中F為晶體天然諧振頻率(Hz)，Δm為沉積在晶體表面的質(zhì)量變化(g)，ΔF為晶體頻率的變化(Hz)，A為參與晶振的面積(cm2)。壓電生物傳感技術(shù)得到迅速發(fā)展，應(yīng)用廣泛。Su等在石英晶體表面固定DNA，用于檢測(cè)抗癌鉑藥物的含量，檢測(cè)限為l0-7mol/L[10]；Liu等使用串聯(lián)電極壓電晶體傳感器對(duì)L-谷氨酸進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限為3.8×lO-5mol/L[11]。

2.2 核磁共振(NMR)

如同紫外線或紅外線的吸收會(huì)產(chǎn)生電子躍遷一樣，吸收適當(dāng)頻率的電磁輻射線也能引起由強(qiáng)磁場產(chǎn)生的原子核磁級(jí)的躍遷。分子環(huán)境影響磁場中原子核的吸收，影響因素與分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。測(cè)量系統(tǒng)由一個(gè)高頻源、磁場及其它裝置成直角安裝的高頻檢測(cè)裝置組成。加入樣品后，接收器中出現(xiàn)信號(hào)。光譜由磁場或者高頻的掃描產(chǎn)生，光譜中各個(gè)峰面積與樣品的量成正比。用于生化過程檢測(cè)的質(zhì)子核磁共振需碳-13核磁共振來說明，因其為生物結(jié)構(gòu)的需要，而且碳-13核磁共振能提供分離得更好、更窄、更少的峰。NMR除與FIA技術(shù)結(jié)合應(yīng)用以外，也可直接進(jìn)行檢測(cè)。Sarazin等[12]采用NMR法對(duì)正丁醇與辛酸在角質(zhì)化酶的催化下發(fā)生酯化反應(yīng)的過程進(jìn)行了檢測(cè)，由于使用一種內(nèi)有NMR管的分光探頭，包括水在內(nèi)的所有成份的濃度可被實(shí)時(shí)原位地檢測(cè)出。

2.3 質(zhì)譜分析

根據(jù)待測(cè)物的質(zhì)量與電荷的比例關(guān)系，質(zhì)譜儀能提供試樣中不同分子量物質(zhì)的濃度數(shù)據(jù)，并在磁場中將離子化了的氣體樣品進(jìn)行分離。質(zhì)譜儀可以通過對(duì)間歇發(fā)酵罐中易揮發(fā)成分或尾氣成分的分析間接得到培養(yǎng)液中化學(xué)組成變化的信息。當(dāng)硅管探頭與質(zhì)譜儀一起使用時(shí)，它能對(duì)多級(jí)發(fā)酵罐進(jìn)行精確測(cè)量。Srinivasan等[5]研究了一種耐酒精基因工程酵母1400對(duì)葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，并采用膜進(jìn)樣質(zhì)譜分析法(MIMS)結(jié)合FlA技術(shù)對(duì)發(fā)酵底物葡萄糖，主要產(chǎn)物乙醇及微量產(chǎn)物乳酸和甘油的濃度進(jìn)行了在線監(jiān)測(cè)，避免了由于底物葡萄糖濃度過高而阻礙乙醇生成的現(xiàn)象發(fā)生，從而提高了乙醇產(chǎn)量。Hansen[13]采用MIMS結(jié)合FIA技術(shù)對(duì)青霉素V發(fā)酵進(jìn)行了在線監(jiān)測(cè)，迅速簡便，結(jié)果準(zhǔn)確。

2.4 生物分子交感分析(biomolecular interaction analysis，BlA)

BIA技術(shù)是基于一種表面等離子共振(SPR)的物理光學(xué)現(xiàn)象發(fā)展起來的新型生物傳感分析技術(shù)。當(dāng)入射光以臨界角入射到兩種不同透明介質(zhì)的界面時(shí)將產(chǎn)生全反射，且反射光強(qiáng)度在各個(gè)角度上都應(yīng)相同，但若在介質(zhì)表面鍍上一層金屬薄膜后，由于入射光可引起金屬中自由電子的共振，從而導(dǎo)致反射光在一定角度內(nèi)大大減弱，其中使反射光完全消失的角度稱作共振角。共振角會(huì)隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，巳折射率的變化又可結(jié)合作金屬表面的生物大分子質(zhì)量成正比。因此，BlA技術(shù)可以通過對(duì)反應(yīng)全過程中各種分子反射光的吸收獲得初始數(shù)據(jù)，并經(jīng)相關(guān)處理獲得結(jié)果。用SPR檢測(cè)器所得的信息可直接來自表面的樣品，也可間接來自能與樣品特異結(jié)合的相關(guān)試劑，且該相關(guān)試劑一方面可以放大樣品信號(hào)，另一方面還可以從粗樣品的嘈雜信號(hào)中獲得微量待測(cè)樣品的特異性信號(hào)。BlA技

術(shù)分析裝置一般由傳感片(實(shí)時(shí)信號(hào)傳導(dǎo)的載體)、微射流卡盤(液體傳送系統(tǒng))、BIA操作輔助軟件三部分組成。

2.5 色譜分析技術(shù)

色譜分析技術(shù)從其出現(xiàn)到目前為止已發(fā)展得相當(dāng)成熟，在生化過程離線檢測(cè)中應(yīng)用廣泛。但近幾年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，已逐漸將色譜法用于在線檢測(cè)，多與硅管探頭取樣裝置或FlA技術(shù)相結(jié)合使用。特別是高效液相色譜和氣相色譜將分離與連續(xù)檢測(cè)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜體系中組分、價(jià)態(tài)和性質(zhì)相近的元素或化合物的分析，比較廣泛地用于培養(yǎng)液中許多成分的測(cè)定[14]。

3 各檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用前景分析

目前存在的各種在線檢測(cè)技術(shù)都具有自身的特點(diǎn)，在不同程度上反映了生物過程的變化信息�？偟膩碚f，能實(shí)現(xiàn)原位檢測(cè)的技術(shù)有更大的發(fā)展優(yōu)勢(shì)，因非原位檢測(cè)需將培養(yǎng)液引流出反應(yīng)器，從而存在一定時(shí)間滯后、過濾膜易被菌體堵塞等缺點(diǎn)。

紅外光譜技術(shù)的新型探頭能耐高溫滅菌，可承受高壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿環(huán)境，實(shí)現(xiàn)原位監(jiān)測(cè)，適用面廣。體系中存在氣泡、固體顆粒、懸浮物不干擾測(cè)定，且不破壞樣品。不影響正常培養(yǎng)過程。但當(dāng)多組分共存時(shí)譜峰重疊現(xiàn)象普遍。目前化學(xué)計(jì)量學(xué)中對(duì)混合物多成分同時(shí)定量分析的迅速發(fā)展，重疊峰分解、多元非線性修正、多次疊加平均、因子分析、偏最小二乘法等對(duì)不同樣品和測(cè)量誤差的計(jì)算和修正等的發(fā)展，為避免紅外光譜這一缺陷提供了條件和可能性。

熒光分析法靈敏度很高，其中酶鍵合標(biāo)記法所用的光纖探頭因未使用固定化生物活性物質(zhì)，能承受高溫滅菌處理，若在同一傳感器內(nèi)放入多種鍵合劑，可同時(shí)測(cè)定多個(gè)代謝物。直接熒光測(cè)量法簡便易行，不用另加試劑。但酶鍵合標(biāo)記法所使用的電極易受其它代謝物干擾，專一性不如酶電極。同時(shí)培養(yǎng)液溫度、粘度、pH值以及光散射，熒光淬滅現(xiàn)象對(duì)熒光分析均有影響。在實(shí)際測(cè)試中，應(yīng)根據(jù)不同的對(duì)象、不同的影響因素，分清主次，依具體情況采用合理的措施，以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

離子敏場效應(yīng)晶體管具有高輸入阻抗、低輸出阻抗、響應(yīng)快、抗干擾及靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，且這種傳感器體積很小，價(jià)格低廉，可望廣泛用于實(shí)際檢測(cè)中。核磁共振技術(shù)可對(duì)過程流體及其組成進(jìn)行非接觸、不干擾的測(cè)量；BIA技術(shù)能快速自動(dòng)化，且樣品也無需標(biāo)記，均是有廣闊發(fā)展前景的技術(shù)。

生物傳感器靈敏、專一、微量、快速、準(zhǔn)確，具有特異的生物分子識(shí)別功能均快速的物理化學(xué)方法相結(jié)合的特點(diǎn)，其中壓電技術(shù)儀器裝置簡單，無需標(biāo)記物。但此類傳感器均不能

經(jīng)受高溫滅菌，且微生物電極有易導(dǎo)致物質(zhì)染菌的缺點(diǎn)。

質(zhì)譜分析技術(shù)偏差小、響應(yīng)快、精度高、維修問題少，但儀器設(shè)備昂貴，不討微處理機(jī)的問世有助于降低質(zhì)譜儀的價(jià)格，也降低了調(diào)節(jié)它的復(fù)雜性。

色譜分析技術(shù)雖然發(fā)展成熟，測(cè)定精確，但其需復(fù)雜的預(yù)處理，測(cè)樣時(shí)間長；是一種理想的在線檢測(cè)技術(shù)。