一、原理
在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細(xì)胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細(xì)胞最易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細(xì)胞（同實驗二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復(fù)蘇
1、準(zhǔn)備一個茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。
3、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。