分光光度計的原理就是根據(jù)朗伯-比爾定律,我們簡單點來說,就是不同濃度的樣品有不同的吸光度,吸光度和樣品濃度成函數(shù)關(guān)系,根據(jù)這種關(guān)系,我們就能夠測出未知量的濃度。
分光光度計根據(jù)波長不同主要是分為三種:紫外分光光度計、可見分光光度計、和近紅外分光光度計。我們今天主要說紫外可見分光光度計。
A段(190-340)nm、B段(340-900)nm、C段(900-2600)nm由下圖可知,分光光度計可分為四個等級,我們常用的一般都是Ⅲ或Ⅳ級。
紫外區(qū)主要是氘燈,氘燈提供的光源在(180~375)nm,關(guān)于氘燈的壽命大概在1000小時左右,可見區(qū)主要是用的鎢燈,鎢燈提供的光源在(320~2500)nm,鎢燈就是我們小時候用的電燈泡,壽命的話比氘燈要長點,具體儀器得具體分析了(1000-2000)h左右。
大家需要注意的是不同的光區(qū),使用不同的吸收池,紫外區(qū)用的是石英吸收池,可見區(qū)用的是玻璃吸收池。不容易被磨損的,就是石英吸收池。還有一種比較容易的辦法,就是石英吸收池和玻璃吸收池,在紫外區(qū)有不同的吸光度,在250nm波長時,如果吸光度<0.07Abs的就是石英吸收池。
吸光度的范圍:由于分光光度計原理是根據(jù)朗伯-比爾定律,我們做樣品時,盡可能的將吸光度控制在1以內(nèi),具體原因有興趣的可以去計算。
A=lg(1/T)=Kbc
A為吸光度,T為透射比(透光度),是出射光強度(I)比入射光強度(I0).
c為吸光物質(zhì)的濃度,單位為mol/L,b為吸收層厚度,單位為cm
關(guān)于分光光度計預(yù)熱時間,一般要求在20min左右。這個也很好理解,就是小時候那種家用燈泡,剛開啟時沒有那么亮,等段時間后會慢慢變亮。穩(wěn)定后,我們做樣品才能穩(wěn)定可靠。
透射比和吸光度的換算:分光光度計上就這兩個測量量,透射比和吸光度什么關(guān)系呢?吸光度 = -log(透射比)。