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本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(Coliforms)計(jì)數(shù)的方法。
本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較 高的食品中大腸菌群的計(jì)數(shù)。
二、術(shù)語(yǔ)和定義
1 大腸菌群 Coliforms
在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。
2 最可能數(shù) Mostprobablenumber
MPN 基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。
三、檢驗(yàn)原理
1、MPN法
MPN 法是統(tǒng)計(jì)學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測(cè)法。待測(cè)樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長(zhǎng)的最低稀釋度與生長(zhǎng)的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)概率論推算出待測(cè)樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。
2、平板計(jì)數(shù)法
大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計(jì)數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。
四、設(shè)備和材料
除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:
.恒溫培養(yǎng)箱:36 ℃ ±1 ℃
.冰箱:2 ℃~5 ℃
.恒溫水浴箱:46℃±1℃
.天平:感量 0.1g
.均質(zhì)器
.振蕩器
.無(wú)菌吸管:1mL(具 0.01mL 刻度)、10mL(具 0.1mL 刻度)或微量移液器及吸頭
.無(wú)菌錐形瓶:容量500mL
.無(wú)菌培養(yǎng)皿:直徑 90mm
.pH 計(jì)或 pH 比色管或精密pH 試紙
.菌落計(jì)數(shù)器
五、培養(yǎng)基和試劑
.月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉湯
.煌綠乳糖膽鹽(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉湯
.結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violetredbileagar,VRBA)
.無(wú)菌磷酸鹽緩沖液
.無(wú)菌生理鹽水
.1mol/LNaOH 溶液
第一法：大腸菌群 MPN計(jì)數(shù)法
一、檢驗(yàn)程序
二、操作步驟
1、樣品的稀釋
①固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi) ,8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。
②液體樣品:以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶 (瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠)或其他無(wú)菌容器中充分振搖或置于機(jī)械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。
③樣品勻液的pH 應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時(shí)分別用1mol/LNaOH 或1mol/L HCl調(diào)節(jié)。
④用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖 液或生理鹽水的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無(wú)菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。
⑤根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過(guò)程不得超過(guò)15min。
2、初發(fā)酵試驗(yàn)
每個(gè)樣品,選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個(gè)稀釋度接種3管 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過(guò)1mL,則用雙料LST肉湯),36 ℃±1℃培養(yǎng)24h±2h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn)),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。
3、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)(證實(shí)試驗(yàn))
用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1 環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中，36 ℃±1 ℃培養(yǎng)48h±2h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計(jì)為大腸菌群陽(yáng)性管。
4、可能數(shù)(MPN)的報(bào)告
根據(jù)確證的大腸菌群BGLB陽(yáng)性管數(shù),檢索 MPN 表,報(bào)告每g(mL)樣品中大腸菌群的 MPN 值。
現(xiàn)行有效的16版&03版
第二法：平板計(jì)數(shù)法
一、檢驗(yàn)程序：
1、樣品的稀釋
按MPN法中的稀釋方法進(jìn)行
2、平板計(jì)數(shù)
①選取2個(gè)~3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度,每個(gè)稀釋度接種2個(gè)無(wú)菌平皿,每皿1mL。同時(shí)取1mL 生理鹽水加入無(wú)菌平皿作空白對(duì)照。
②及時(shí)將15mL~20mL融化并恒溫至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個(gè)平 皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA 覆蓋平板表 層。翻轉(zhuǎn)平板,置于36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~24h。
3、平板菌落數(shù)的選擇
選取菌落數(shù)在15CFU~150CFU 之間的平板,分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落 (如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm 或更大,最低稀釋度平板低于15CFU 的記錄具體菌落數(shù)。
4、證實(shí)試驗(yàn)
從 VRBA 平板上挑取10個(gè)不同類型的典型和可疑菌落,少于10個(gè)菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于 BGLB肉湯管內(nèi),36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣, 即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性
5、大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告
經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以計(jì)數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每 g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在 VRBA平板上有100個(gè)典型和可疑菌落,挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管,證實(shí)有6個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:
100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀 釋倍數(shù)計(jì)算。
備注:
6.0×105CFU/g(mL)也 就是600000CFU/g(mL)這個(gè)作為公司統(tǒng)一的數(shù)據(jù)修約后的報(bào)告方式，若均無(wú)菌落生長(zhǎng)則報(bào)告值為<10CFU/g(mL)
例: 10-2樣品稀釋液1mL，在VRBA平板上有90個(gè)典型和可疑菌落，挑取其中10個(gè)接種BGLB肉湯管，證實(shí)有10個(gè)陽(yáng)性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為: 90×10/10×102/g(mL)=9000CFU/g(mL)
