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1、我的細(xì)胞提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？
答：有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻](méi)有變性全，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時(shí)將樣品煮沸時(shí)間延長(zhǎng)； 也不排除你的抗原濃度過(guò)高，這時(shí)再加入適量上樣緩沖液即可。
2、我做的蛋白質(zhì)分子量很�。�10kd），請(qǐng)問(wèn)怎么做WB？
答：可以選擇0.2μm的膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉(zhuǎn)移。
3、最后顯色時(shí)用 DAB好還是ECM好？
答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時(shí)靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測(cè)pg 級(jí)蛋白，具體可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)的情況。
4、要驗(yàn)證某個(gè)細(xì)胞上有無(wú)該蛋白的存在，需要做免疫組化和Western Blot試驗(yàn)嗎？做這兩個(gè)試驗(yàn)時(shí)的一抗和二抗可以共用嗎？
答：
①免疫組化可以用來(lái)進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時(shí)會(huì)有假陽(yáng)性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測(cè)某個(gè)蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定 量，但是不能定位。
②兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時(shí)候不能通用，公司的產(chǎn)品說(shuō)明一般都會(huì)說(shuō)明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時(shí)，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
5、細(xì)胞水平要做Western Blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做Western Blot？
答：一般5×106就足夠了。
6、同一樣品能同時(shí)提RNA又提蛋白么？這樣對(duì)Western Blot有無(wú)影響？
答：能，沒(méi)有問(wèn)題。
7、同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)嗎？
答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
8、蛋白變性后可以存放多久？
答：－80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。
9、二抗是生物素化的抗體，三抗是親和素生物素體系，不知采用這樣的方案后，封閉液是否要作調(diào)整，能否再用5％的脫脂奶粉呢？
答：不能使用脫脂奶粉，因?yàn)槊撝谭壑泻锼�，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn)。
10、做組織樣品的Western Blot的時(shí)候，怎樣處理樣品？
答：必須進(jìn)行研磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會(huì)更好，離心要充分，膜蛋白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提(超速離心)。還有一點(diǎn)就是組織中的蛋白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性。
11、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？
答：免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱(chēng)表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于免疫組化。
12、在做Western Blot時(shí)，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？
答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)，使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。
13、檢測(cè)同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？
答：可以。
14、蛋白質(zhì)的分子量跨度很大，如要分離小21kd，中至66kd，大至170kd，可以一次做好嗎？
答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移，一般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12％SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)120mA， 45-60min就可以了， 可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用 7% SDS－PAGE，200mA 90-120min。
15、細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時(shí)有什么原則嗎？受不受組織來(lái)源的影響？胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？
答：一般來(lái)說(shuō)提取時(shí)加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時(shí)保持低溫。若有特殊要求可以選擇相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。
