1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，開(kāi)創(chuàng)了分子生物學(xué)的新時(shí)代。三十多年來(lái)有關(guān)DNA的研究有了飛躍的發(fā)展�；蚬こ叹褪侵冈谠嚬軆�(nèi)人為地把DNA分子進(jìn)行切割、拼接（即重組），再設(shè)法把它放回到細(xì)胞中去進(jìn)行擴(kuò)增，并表達(dá)產(chǎn)生人們所需要的蛋白。這樣就可以按照人們的意愿創(chuàng)造新的生命形態(tài)，表現(xiàn)新的遺傳學(xué)特往。這種DNA重組技術(shù)，不僅使基因研究在理論上有新的突破，而且產(chǎn)生了基因工程工業(yè)。它被認(rèn)為是二十世紀(jì)生物學(xué)一項(xiàng)偉大的成就，也是當(dāng)今第三次工業(yè)革命的重要組成部分。
病毒基因工程，就是指DNA重組技術(shù)在病毒學(xué)中的應(yīng)用。它是近十年來(lái)基于分子病毒學(xué)、分子生物學(xué)、微生物遺傳學(xué)以及細(xì)胞生理學(xué)的發(fā)展而形成的一個(gè)邊緣性的應(yīng)用科學(xué)領(lǐng)域。病毒基因工程技術(shù)，不僅對(duì)病毒學(xué)本身規(guī)律的基礎(chǔ)研究十分重要，而且更主要的它又是研究病毒性疾病防治關(guān)鍵問(wèn)題的一種必要手段。
一、病毒學(xué)發(fā)展的三個(gè)階段 隨著生物學(xué)研究技術(shù)的不斷革新，病毒學(xué)的發(fā)展大致經(jīng)歷了如下三個(gè)階段。 （一）機(jī)體水平研究階段 在40年代以前，病毒學(xué)工作者主要采用敏感動(dòng)物（如小白鼠）或動(dòng)物胚胎（如雞胚）來(lái)分離、鑒定病毒，研究病毒的繁殖、發(fā)病機(jī)理、兔疫反應(yīng)等，甚至使用受染動(dòng)物組織制備疫苗，如狂犬病疫苗等。 （二）細(xì)胞水平研究階段 在40～60年代，由于組織培養(yǎng)技術(shù)廣泛應(yīng)用于病毒學(xué)領(lǐng)域，相繼分離了上百種過(guò)去對(duì)動(dòng)物不敏感的新病毒，如腺病毒、副流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、ECHO病毒等，大大擴(kuò)展了病毒學(xué)研究的范圍。組織培養(yǎng)技術(shù)不僅為臨床病毒學(xué)的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)，而且還用于病毒復(fù)制和遺傳方面的研究，對(duì)病毒本質(zhì)有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。此外，一批經(jīng)濟(jì)、安全、有效的組織培養(yǎng)疫苗誕生了，如脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、風(fēng)疹、腮腺炎疫苗等，為預(yù)防病毒性疾病做出了貢獻(xiàn)。 （三）分子水平研究階段 60 另一方面，分子病毒學(xué)的研究成果，對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展也起了很大的推動(dòng)作用。RNA腫瘤病毒反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)，不僅充實(shí)了闡明DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和mRNA的翻譯表達(dá)及蛋白產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能三者關(guān)系的中心法則，而且在實(shí)際應(yīng)用上，使RNA在試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄成cDNA成為可能。病毒基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的研究，還闡明了有關(guān)真核基因表達(dá)調(diào)控的某些原理，如基因重疊、間隙、內(nèi)含子的發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄后剪修，重復(fù)序列和增強(qiáng)子的存在等，都大大豐富了分子生物學(xué)的內(nèi)容。病毒載體的出現(xiàn)，又為研究真核細(xì)胞基因表達(dá)提供了一個(gè)重要的手段。目前，分子病毒學(xué)還處于發(fā)展階段。 二、病毒基因工程的主要內(nèi)容和重要性 根據(jù)目前DNA重組技術(shù)的發(fā)展及分子病毒學(xué)研究的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢(shì)，病毒基因工程包括如下主要內(nèi)容。 （一）病毒基因組的克隆、結(jié)構(gòu)測(cè)定和表達(dá) 要研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，一般須先建立病毒基因組的無(wú)性繁殖系，這樣才能獲得足夠量的病毒DNA。后者可采用細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)�；�λ噬菌體作為載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌來(lái)完成。大的DNA病毒基因組可用限制性?xún)?nèi)切酶切割成幾個(gè)片段進(jìn)行克隆；RNA病毒可先在試管內(nèi)反轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行克隆；反轉(zhuǎn)錄病毒基因組可克隆其前病毒DNA。建立了病毒基因組的無(wú)性繁殖系后，就可以采用化學(xué)法（Maxam et al 1977）或酶促法（Sanger et al 1977；Messing et al 1981）測(cè)定病毒基因組的核苷酸序列，以了解基因的一級(jí)結(jié)構(gòu)；結(jié)合在試管內(nèi)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯試驗(yàn)，或基因缺失變異株的互補(bǔ)試驗(yàn)等，就可逐步闡明其結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，并了解基因表達(dá)調(diào)控的某些原理。在此基礎(chǔ)上，就可以設(shè)計(jì)組建病毒載體或表達(dá)病毒多肽。。 （二）病毒基因工程疫苗的研制 對(duì)產(chǎn)生中和抗體的病毒多肽基因高效表達(dá)的研究，導(dǎo)致了新一代病毒疫苗的誕生。鑒于動(dòng)物病毒的自然宿主是動(dòng)物細(xì)胞，所以動(dòng)物病毒基因表達(dá)的模式與其他真核基因是類(lèi)似的。眾所周知，真核基因與原核基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，在許多方面是不相同的（表1－2），其中最主要的是真核基因的不連續(xù)性，以及其調(diào)控信號(hào)不能為原核細(xì)胞正確識(shí)別。所以病毒基因在一般情況下，最好采用真核細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)表達(dá)。也就是說(shuō)，病毒基因工程疫苗要采用真核細(xì)胞系統(tǒng)來(lái)完成。可是，如果病毒基因先在試管內(nèi)從mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，也可以在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。目前，用于制備病毒基因工程疫苗的表達(dá)系統(tǒng)的種類(lèi)和優(yōu)缺點(diǎn)詳見(jiàn)表1－3。 病毒基因工程疫苗雖然還存在一些問(wèn)題，但是與采用經(jīng)典方法生產(chǎn)的病毒疫苗相比較，仍有許多明顯的優(yōu)點(diǎn)： 1 2. 3 4 5 （三）抗病毒多肽物質(zhì)的研制 如表1－4所示，自1979年底以來(lái)，不少人和動(dòng)物的干擾素基因已經(jīng)克隆成功。人 干擾素基因在原核細(xì)胞中已可高效表達(dá)，每升大腸桿菌菌液可以生產(chǎn)lmg干擾素，相當(dāng)于2～3×108國(guó)際單位干擾素。采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的干擾素具有與自然干擾素相同的生物學(xué)活性，目前已經(jīng)試用于臨床。采用基因工程技術(shù)還可以把幾個(gè)不同型別的干擾素基因拼接起來(lái)，生產(chǎn)具有不同性格的自然界所沒(méi)有的活性多肽物質(zhì)，例如把αD－αA基因拼接后產(chǎn)生的干擾素，既具有具αD的某些性狀，又具有αA的一些性狀。所以DNA重組技術(shù)為生產(chǎn)人造抗病毒多肽物質(zhì)開(kāi)辟了一條新途徑。 （四）動(dòng)物病毒載體的組建 原核細(xì)胞系統(tǒng)的DNA重組技術(shù)，對(duì)真核基因，包括動(dòng)物病毒基因的克隆、鑒定，無(wú)疑是十分必要的，因?yàn)檎婧嘶蚬こ痰钠鹗疾襟E，多先在原核細(xì)胞內(nèi)完成。但是，正如表1－2所示，真核基因與原核基因的結(jié)構(gòu)與表達(dá)調(diào)節(jié)有很大的差別，要進(jìn)行病毒基因或其他直接基因的表達(dá)調(diào)節(jié)研究，就必須建立一種真核基因工程系統(tǒng)。考慮到λ噬菌體載體（一種細(xì)菌的病毒）在大腸桿菌克隆系統(tǒng)中表現(xiàn)出很多優(yōu)點(diǎn)，許多學(xué)者也就對(duì)采用動(dòng)物病毒作為真核細(xì)胞克隆和表達(dá)的載體，寄予很大的希望�？墒�，動(dòng)物病毒與噬菌體各有許多不同的特點(diǎn)，在使用或改組動(dòng)物病毒作為載體時(shí)，應(yīng)當(dāng)注意下列問(wèn)題： 1 但是，痘苗病毒基因組比較大，有較大的非必需區(qū)，作為病毒載體是很有前途的。 2. 3 4 動(dòng)物病毒載體的組建有兩種類(lèi)型：第一是組建含有目的基因的感染性重組病毒，隨著病毒的繁殖，使目的基因有效表達(dá)。采用這一系統(tǒng)時(shí)，除反轉(zhuǎn)錄病毒外，大多數(shù)感染性病毒可以殺死細(xì)胞。第二是建立一種能使病毒載體復(fù)制的游離基因，其優(yōu)點(diǎn)是，可以用來(lái)建立不產(chǎn)生感染性病毒顆粒就可以不斷表達(dá)外源性基因的細(xì)胞系，而且還可以克服病毒顆粒包裝容量的限制。根據(jù)不同目的和要求，這兩類(lèi)動(dòng)物病毒載體各有其用處。 動(dòng)物病毒載體的用途有如下幾方面： 1 2 3 4 三、病毒基因工程的主要環(huán)節(jié) （一）供體DNA或外源性DNA 它可以通過(guò)提取、人工合成或從mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得。由于大多數(shù)真核基因和病毒基因有插入順序，所以從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA往往不能完全代表真核基因的真正結(jié)構(gòu)。 （二）載體 載體也就是轉(zhuǎn)移外源性DNA片段的運(yùn)載體，常用的有細(xì)菌質(zhì)粒、粘性質(zhì)粒、酵母質(zhì)粒、噬菌體或動(dòng)物病毒。根據(jù)不同的目的和要求選用不同的載體系統(tǒng)，也可不用載體把外源性DNA直接轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。 （三）受體細(xì)胞 受體細(xì)胞就是指作為DNA重組體增殖或復(fù)制的宿主細(xì)胞。如果采用細(xì)菌時(shí)，要考慮到安全性。目前認(rèn)為，大腸桿菌K12品系是安全的。如采用動(dòng)物細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)疫苗或其他活性多肽時(shí)，要考慮到潛在的致癌因子。 （四）重組體的改造與基因表達(dá) 外源性DNA與載體DNA的連接，以及重組體的改造大致有如下幾種方法： 1 2 3 4. 5 6 基因表達(dá)考慮的因素較多。總結(jié)病毒基因工程的主要環(huán)節(jié)如表1-5。 
