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間接紅血球凝集反應(yīng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

間接紅血球凝集反應(yīng)(簡(jiǎn)稱間接血凝)是間接凝集反應(yīng)中應(yīng)用最廣的一種方法。

原理

以紅血球?yàn)檩d體的間接凝集反應(yīng)叫做間接血凝。將抗原吸附在紅血球上用以檢測(cè)微量抗體稱為正向間接血凝,以抗體吸附于紅血球上,檢測(cè)相應(yīng)的抗原,稱為反向間接血凝。

用抗原吸附紅血球,一般比較容易,但用免疫血清吸附紅血球,則困難得多,而且往往不易獲得良好的結(jié)果,因?yàn)槊庖哐逯械某煞址浅?fù)雜。許多其他蛋白質(zhì)和非抗體活性的免疫球蛋白占據(jù)紅血球的表面,而影響血球的特異性凝集。

材料與試劑

1.紅血球

2.反應(yīng)板 分聚苯乙烯塑料板和有機(jī)玻璃板(聚甲基丙烯酸甲酯),每板又有96孔和72孔兩種規(guī)格。按孔型又可分為VU型兩種,V型具有更典型的凝集模型,U型有時(shí)比V型的血清效價(jià)高12孔。反應(yīng)板不能煮沸消毒和浸泡于來(lái)蘇兒水中。消毒可用0.5%甲醛溶液,1%新潔爾滅及紫外線照射等。

3.稀釋棒 由合金制成。棒頭有8條溝,吸液量為0.025ml,通過(guò)火焰,使表面氧化變粗易于吸取液體。它的作用是蘸取、轉(zhuǎn)移、混合液體。為了長(zhǎng)期保持棒頭的氧化層,每使用20次左右,應(yīng)過(guò)火焰一次。

4.標(biāo)準(zhǔn)滴管 每滴0.025ml

5.微型振蕩器

6.兔血清鹽水 作為穩(wěn)定劑,用于懸浮致敏紅血球以及稀釋供試血清。制法為:無(wú)菌采取兔血,收集血清,滅活后4保存。同時(shí),取所需量加4倍量的2.5%血球懸液,混勻,37水浴10min,以吸附異嗜性凝集素,離心后取上清;再以pH7.2PBS稀釋成1%兔血清鹽水,冰箱保存可供數(shù)日內(nèi)之用。

7.抗原 盡可能使用高純度的抗原。

8.供試血清或其它含抗體材料 供試血清必須滅活,加92.5%的紅血球懸液,37水浴10min20min,進(jìn)行吸收,然后離心,取上清,即為1:10的血清稀釋液。

9.醛化劑 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

10.優(yōu)質(zhì)鞣酸

110.15Mol/L pH6.4PBS液,用于紅血球致敏。

120.15Mol/L pH7.2PBS液,用于一般稀釋液。

130.02%牛血清白蛋白PBS

14.生理鹽水

紅血球的處理

1.新鮮紅血球 新鮮紅血球用阿氏液保存于4,可供3周內(nèi)使用。采用新鮮紅血球做凝集反應(yīng),模型新鮮,典型,而且敏感性也比醛化紅血球高出12個(gè)滴度。但用新鮮紅血球致敏后,保存時(shí)間短,而且不同動(dòng)物個(gè)體和不同批次來(lái)源的紅血球均有差異,影響試驗(yàn)結(jié)果和分析。為了克服這一缺點(diǎn),目前多采用醛化紅血球或鞣化紅血球。

2.紅血球醛化極其優(yōu)點(diǎn)

1)醛化方法:常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化過(guò)程:①將紅血球用pH7.2PBS反復(fù)洗滌4次,以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質(zhì);②按18的比例取紅血球(壓積)和3%甲醛液(用pH7.2PBS稀釋,預(yù)先冷卻至4),緩慢混合,加膠塞4作用24h,不時(shí)搖動(dòng);③傾去上清液,再以12VV)加入36%~38%冷的(10)甲醛溶液,混勻,再放入424h;④⑷離心去上清,以生理鹽水反復(fù)洗滌4次。徹底清除甲醛液,最后以生理鹽水配成10%懸液甲醛化紅血球,加1/萬(wàn)硫柳汞防腐,4保存。

戊二醛醛化過(guò)程:①取新鮮紅血球,以生理鹽水洗滌4次;②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1%戊二醛溶液,4保存?zhèn)溆;③?/span>100ml 1%冰冷的戊二醛液加入到10ml15ml紅血球中,邊加邊攪拌(也可置電磁攪拌器上)30min;④離心去上清,以生理鹽水洗滌4次,最后以PBS液(或生理鹽水)配成10%懸液,加1/萬(wàn)硫柳汞,4保存。

丙酮醛—甲醛雙醛化過(guò)程:①取新鮮紅血球,洗滌4次,配成8%的懸液;②于紅血球懸液中加等量的3%丙酮醛室溫電磁攪拌16h18h;③洗滌5次,再配成8%的懸液;④于紅血球懸液中加等量的3%甲醛,電磁攪拌16h18h;⑤洗滌5次,最后以pH 7.2 PBS配成10%的懸液,加1/萬(wàn)硫柳汞防腐,4保存。

3)醛化紅血球的優(yōu)點(diǎn):①性質(zhì)穩(wěn)定,不影響紅血球表面的吸附能力;②重復(fù)性好,易標(biāo)準(zhǔn)化。③可較長(zhǎng)期保存,醛化后4保存,有效期可至1年,如凍干保存,有效期則更長(zhǎng)。

4)影響醛化的因素:①紅血球的潔凈程度:由于紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質(zhì),易引起自家凝集,所以一定要充分洗凈;②紅血球的濃度:醛化時(shí)應(yīng)盡量使紅血球稀釋度低一些,以減少紅血球的凝集和變形;③醛化時(shí)的溫度與醛化紅血球的質(zhì)量有很大關(guān)系,一般認(rèn)為最好是37。但有人認(rèn)為應(yīng)于4進(jìn)行醛化;④醛化劑的濃度和醛化次數(shù):醛化劑的濃度過(guò)大,易引起紅血球皺褶,濃度過(guò)低,又會(huì)增加溶血機(jī)會(huì),所以一般以3%醛化濃度為宜。家禽紅血球一般醛化12次即可,而哺乳動(dòng)物紅血球醛化2次比醛化1次要好,敏感性高,保存時(shí)間也長(zhǎng)。不同的雙醛化,其抗原致敏作用有所不同。

各種雙醛化紅細(xì)胞的結(jié)果比較

上海第六

人民醫(yī)院

首都

醫(yī)院

國(guó)外

資料

抗原滴度

抗原滴度

脈沖/min

抗原滴度

脈沖/min

丙酮醛+甲醛

戊二醛+丙酮醛

丙酮醛+戊二醛

217

219

215

211

51075118

2×106

6×106

6×106

1684

2154

3750

脈沖/min131I標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合到細(xì)胞上的指標(biāo),脈沖數(shù)越大,結(jié)合抗體量也越多。但是從表51中可以看出結(jié)合量同可測(cè)出的抗原滴度是不平行的。

適當(dāng)?shù)恼袷幙墒谷┗瘎┡c紅血球充分接觸,并可排除凝塊形成。但過(guò)分地振蕩,則易產(chǎn)生氣泡,引起紅血球變形。

3.紅血球鞣化 多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易于吸附紅血球表面,所以一般醛化處理即可。但對(duì)于許多蛋白質(zhì)抗原,由于不易吸附于紅血球表面,所以在醛化的基礎(chǔ)上,必須再以一定濃度的鞣酸進(jìn)行處理,強(qiáng)化它對(duì)蛋白質(zhì)的吸附能力。

有人認(rèn)為雙醛化后可不必進(jìn)行鞣化。首都醫(yī)院做了“丙酮醛+甲醛+鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數(shù)意見認(rèn)為醛化后仍需鞣化比較好。

(1) 鞣化過(guò)程:①將10%醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次,再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次,最后以PBS配成2.50%懸液;②稱取優(yōu)質(zhì)鞣酸20mg,以生理鹽水4ml配成1200的濃度,于37水浴,使之充分溶解,然后再以pH7.2PBS稀釋成12 000的濃度。當(dāng)天配制、當(dāng)天用完;③12.5%紅血球懸液與112 000鞣酸液充分混合,37水浴10min1 500rmin離心,去上清,用PBS液洗滌1次;④以0.02%牛血清白蛋白PBS液洗滌1次,最后以牛血清白蛋白PBS配成2.5%鞣化紅血球。

2)影響鞣化的因素:①鞣酸的質(zhì)量:這是很重要的,所以必須采用優(yōu)質(zhì)鞣酸。分析純的鞣酸呈面包屑狀,不呈面粉狀,有折光性;②鞣酸的濃度:濃度過(guò)高,可以出現(xiàn)紅血球的凝集現(xiàn)象;濃度過(guò)低,達(dá)不到紅血球的活化作用。醛化過(guò)的紅血球所采用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以12 000為佳;③鞣化時(shí)間:鞣化過(guò)程一般10min15min即可完成。時(shí)間再長(zhǎng)也不能吸附更多的抗原,提高血凝滴度。鞣化時(shí)采用的pH對(duì)吸附抗原和血凝滴度影響不大,一般采用pH7.2PBS液。

紅血球的致敏

1.致敏抗原劑量的確定 一般而言,在一定的范圍內(nèi),抗原的濃度與試驗(yàn)的敏感性呈正比,超過(guò)這個(gè)范圍,再增加抗原,敏感性不會(huì)再提高,而且過(guò)大,有時(shí)會(huì)引起非特異性凝集。當(dāng)采用一種新的抗原時(shí),必須經(jīng)過(guò)試驗(yàn),選擇適當(dāng)?shù)目乖旅魸舛龋窗芽乖♂尦蓭讉(gè)不同的濃度分別致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行試驗(yàn),與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清呈最高滴度的陽(yáng)性反應(yīng)的最小抗原劑量,即為該抗原的單位計(jì)量。致敏時(shí),根據(jù)不同的抗原,可采用24個(gè)單位計(jì)量進(jìn)行致敏。

2.致敏方法 各種抗原的致敏方法大致相同,一般蛋白質(zhì)的致敏方法如下:

所需濃度的抗原 1

pH6.4PBS 4

2.50%的鞣化紅血球懸液 1

混勻,置37水浴30min,離心,沉淀后,以2.5%兔血清生理鹽水洗滌1次,懸浮于1份兔血清生理鹽水中。

3.影響紅血球致敏的因素
⑴要有高純度或高效價(jià)的抗原或抗體。

⑵被致敏抗原或抗體的適當(dāng)劑量和濃度。如抗體一般以μg/ml IgG為宜?关i瘟IgG一般用80μg/ml160μg/ml,抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml,抗豬水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml,抗豬肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml,抗豬弓形體20μg/ml~40μg/ml,抗原一般用0.2mg/ml1mg/ml。

pH:除雞卵蛋白采用4.65.1外,其它通常采用5.66.4,高于7.2或低于4.6均可使紅血球發(fā)生自凝。

⑷致敏溫度:一般為37,范圍是20℃~40。

⑸致敏時(shí)間:一般采用30min為最適時(shí)間,具有良好的特異性和重復(fù)性。也有采用60min。時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)造成紅血球的形態(tài)不整,反應(yīng)結(jié)果紊亂等。

⑹血球濃度:一般為1%,范圍為0.5%~1.5%。

操作方法

可采用試管法、凹窩板法和微量法。前者稀釋度準(zhǔn)確、結(jié)果清晰、終點(diǎn)明確。后者具有節(jié)約材料、操作方便、結(jié)果出現(xiàn)迅速等優(yōu)點(diǎn)。

試管法的供試材料用兔血清鹽水二倍遞減稀釋,每管0.50ml,各管加致敏血球0.05ml,充分振蕩,混勻后置室溫,紅血球完全沉下(需數(shù)小時(shí))或過(guò)夜后判定結(jié)果。

每次試驗(yàn)需做下列對(duì)照:①血清對(duì)照:最高濃度的血清+鞣酸血球;②鞣酸血球?qū)φ眨和醚妍}水+鞣酸血球;③致敏血球?qū)φ眨和醚妍}水+致敏血球;④標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清對(duì)照:稀釋已知滴度的陽(yáng)性血清,加致敏血球以檢驗(yàn)試驗(yàn)的敏感性是否前后一致。

結(jié)果判定

++++:管底呈細(xì)密的顆粒凝集,邊緣不整齊。

+++ :全管底呈光滑的均勻片層,邊緣折疊。

++ :全管底呈光滑的均勻片層,如傘狀。

:管底大部分復(fù)以光滑片層,邊緣稍厚。

± :較“+”面積更小,中央有沉積的紅血球。

:紅血球沉積在管底中央,如小圓盤或鈕扣狀。

以“++”為滴度終點(diǎn)。

 

 
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