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免疫組化常見問(wèn)題及對(duì)策

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

1、染色過(guò)強(qiáng)

原因

解決辦法

抗體的濃度過(guò)高或抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 降低抗體滴度(一般指濃縮性抗體)抗體孵育時(shí)間:室溫1小時(shí)或4℃過(guò)夜
孵育溫度過(guò)高,孵育溫度超過(guò)37 一般室溫20-28
DAB顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或DAB濃度過(guò)高 顯色時(shí)間不能超過(guò)5-10分鐘,以顯微鏡下觀察為準(zhǔn)

2、非特異性背景染色

原因

解決辦法

操作過(guò)程中沖洗不充分

每步?jīng)_洗3×5

組織中含過(guò)氧化物酶未阻斷

可再配置新鮮3%H2O2封閉,孵育時(shí)間延長(zhǎng)

組織中含內(nèi)源性生物素

正常非免疫動(dòng)物血清再封閉

血清蛋白封閉不充分

延長(zhǎng)血清蛋白封閉時(shí)間

3、染色弱

原因

解決辦法

抗體濃度過(guò)低,孵育時(shí)間過(guò)短

提高抗體濃度,孵育時(shí)間不能少于60分鐘

試劑超過(guò)有效使用期

及時(shí)更換試劑

操作中,滴加試劑時(shí)緩沖液未瀝干,致使試劑稀釋

每步滴加試劑前瀝干切片中多余的緩沖液(但防止切片干燥)

室溫太低,低于15

若室溫低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分鐘(或4℃冰箱過(guò)夜)

蛋白封閉過(guò)度

封閉時(shí)間不要超過(guò)10分鐘

4、染色陰性

原因

解決辦法

操作步驟錯(cuò)誤

重新試驗(yàn),設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照

組織中無(wú)抗原

設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照片,以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤 仔細(xì)確定一抗與二抗種屬無(wú)誤

 
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