1. 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2. 標記步驟:
(1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。
(2) 反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。
(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時。
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1小時。
(7) 3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結合物,分裝后,冰凍保存。
3. 結果判定:
(1) 定性及效價滴定:用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色,可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實驗系統(tǒng)里)對酶結合物進行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測定:可用分光光度計測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.4
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 4
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標記步驟比較簡單,重復性好。缺點是酶的利用率低,一般只有2~4%的酶與蛋白質結合。
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS):取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml,NaCl1.8克,加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25%戊二醛液:取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液:取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液:稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG,MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器,分光光度計,離心機。
(12) 透析袋,大、小燒杯,試管,吸管等。