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鐵蛋白免疫電鏡操作步驟

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-27

1.鐵蛋白的提取
⑴ 配制2%硫酸銨液,并以1Mol/L的NaOH或HCl調(diào)pH值,正好為5.85。取1g鐵蛋白溶于100ml的2%硫酸銨液中。
⑵ 加入20%硫酸鎘,使最終濃度為5%,混勻,4℃過夜。
⑶ 1 500g離心(4℃)2h,去上清。仍加2%硫酸銨至100ml,混勻,離心,去除不純沉渣。
⑷ 于上清液中重新加入20%硫酸鎘,重復步驟⑵,離心,去上清。
⑸ 檢查沉渣,置顯微鏡下檢查,應具有典型的黃褐色結(jié)晶,結(jié)晶為六角形,雙一四點結(jié)構(gòu),如結(jié)晶不典型,應繼續(xù)重復以上步驟。
⑹ 以少量的蒸餾水溶解,再加50%飽和硫酸銨溶液,使之沉淀,離心,去上清。
⑺ 重復步驟⑹一次。
⑻ 以少量蒸餾水溶解,常水透析24h后,以0.05Mol/L pH 7.5PBS透析24h。
⑼ 100 000r/min離心2h,去除上部無色上清液(約3/4總量),置4℃過夜。
⑽ 用微孔濾膜(孔徑0.45μ)過濾,使鐵蛋白含量為65mg/ml~75mg/ml,分裝,4℃保存不要凍干保存,以免鐵蛋白結(jié)構(gòu)遭破壞。
2.鐵蛋白-抗體交聯(lián)法
⑴ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將鐵蛋白稀釋成20mg/ml~25mg/ml。
⑵ 以1︰1000(W/W)的比例加入XC液室溫攪拌45min,離心去沉淀。
⑶ 以0.3Mol/L pH 9.5硼酸鹽緩沖液將提純lgG配成5mg/ml,以1︰4的比例(V/V)加入IgG與鐵蛋白-XC液,4℃攪拌48h。
⑷ 以0.1Mol/L碳酸銨溶液透析過夜,以除去多余的異氰酸鹽,再以0.05Mol/l pH 7.5 PBS透析,使pH值恢復到生理水平。
⑸ 超速離心 以1.00×105g離心5h,去上清,沉淀以0.05Mol/L PBS懸浮,再次離心,以除去未結(jié)合的IgG。
⑹ 以血清學及免疫學方法測定結(jié)合抗體的特異性、免疫活性以及標記效應,如果操作步驟嚴格,結(jié)果是滿意的。
3.鐵蛋白-抗體結(jié)合物處理標本
(1)將標本以5%福爾馬林pH 7.2(4℃)PBS液固定40min~60min。
(2)用冷的PBS液洗滌,離心。
(3)如是組織塊,則在解剖顯微鏡下切成更小塊,放入試管中,加入鐵蛋白-抗體結(jié)合物置室溫20min,不時振蕩,
(4)以冷PBS液洗滌三次,離心。
(5)沉淀以2.5%戊二醛固定20min,以PBS洗滌。
(6)再以鋨酸固定,脫水包埋。
也可以先超薄切片,再進行鐵蛋白-抗體結(jié)合物染色。操作如下:
⑴ 將培養(yǎng)細胞以1%福爾馬林PBS液固定(4℃)。
⑵ PBS液洗滌離心。
⑶ 以0.5ml,30%牛血清蛋白PBS液懸浮置入膠透析膜袋中,再將袋置于吸水劑粉末上,待牛血清白蛋白成膠狀物時,將透析袋移至2%戊二醛PBS液(pH7.5)中固定3h。
⑷ 取出,切成小塊,以PBS液洗滌。
⑸ 置干燥器中以硅膠干燥。
⑹ 包埋、切片、在水上收集切片置于經(jīng)4%牛血清白蛋白PBS液處理的披有膠膜的載網(wǎng)上(牛血清白蛋白的處理在于減少鐵蛋白結(jié)合物非特異性吸附于載網(wǎng)上)。
⑺ 滴一滴鐵蛋白-抗體結(jié)合物于載網(wǎng)上。
⑻ 5min后,浮網(wǎng)于PBS液面,標本面向下,以除去多余的結(jié)合物。
⑼ 涼干后,滴一滴乙酸雙氧鈾或氫氧化鉛以復染。
⑽ 水洗、晾干、電鏡觀察。

 
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