酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中最常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過(guò)氧化物酶，簡(jiǎn)稱HRP)國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。
(一) 酶制劑及其底物
凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：(1)來(lái)源方便，易于純化；(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定；(3)酶活性和量能用簡(jiǎn)單方法測(cè)定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以最常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58％以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm ／OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(最高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。
HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。5AS(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無(wú)色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過(guò)量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰（說(shuō)明H２O２已消耗殆盡）。這樣即使再延長(zhǎng)時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。
(二) HRP標(biāo)記抗體的方法
酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。尤以簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法更為常用。
戊二醛二步法
1. 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
2. 標(biāo)記步驟：
(1) 稱取HRP25mg溶于1.25％戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)夜。
(2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml／1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3) 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。
(7) 3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
3. 結(jié)果判定：
(1) 定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。最后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測(cè)定：可用分光光度計(jì)測(cè)定(光程1cm)。
酶量(mg／ml)＝OD403nm×0.4
IgG量(mg／ml)＝OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62
酶量(mg／ml) IgG量(mg／ml) 酶量
克分子比值＝──────── ÷ ─────── ＝ ─── × 4
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標(biāo)記步驟比較簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有2～4％的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。
4. 試劑及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25％戊二醛液：取25％戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法
本法是以NaIO４先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70％的HRP和Ig結(jié)合，99％的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無(wú)重大損失，是目前最常用的方法。
1. 原理：經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來(lái)Wilson等改用在低PH下使NaIO４氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO４氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。
2. 標(biāo)記步驟:
(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO４溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過(guò)夜。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。
(5) 加0.1ml新配的4mg／ml NaBH４液，混勻，再置4℃2小時(shí)。
(6) 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過(guò)夜。
其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。
3. 結(jié)果判定：
除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg／ml)＝(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4. 試劑及器材:
(1) 0.1M NaIO４：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)830602)溶于蒸餾水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液:
0.2M NaAc (1.361克／50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml／50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:
Na２CO３ 0.32克
NaHCO３ 0.586克
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
(4) NaBH４溶液(4mg／ml):
臨用時(shí)稱取NaBH４4mg溶于1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)記法。
(三) 工作濃度的選擇
在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過(guò)高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過(guò)低又可影響測(cè)定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。
酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過(guò)一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來(lái)確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià)，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過(guò)夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時(shí)后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO４ 0.05ml終止反應(yīng)。
結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率最大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。
有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見ELISA部分。
要說(shuō)明的是，本法為ELISA直接法，所測(cè)的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的最適濃度可相差幾個(gè)滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度(可采用方陣法)，以達(dá)到最適的實(shí)驗(yàn)條件。
(四) 注意事項(xiàng)
1. 在具備高質(zhì)量HRP的條件下，所要標(biāo)記的抗體也要活性高,效價(jià)高(最低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標(biāo)記物效價(jià)高，免疫活性好的首要條件。
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴(yán)格掌握。所用試劑，最好(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標(biāo)記法中所用戊二醛應(yīng)為新鮮純品，因戊二醛儲(chǔ)存過(guò)久可形成縮和體(雜質(zhì))。否則，影響標(biāo)記效果。
3. 室溫?cái)嚢钑r(shí)須避光，室內(nèi)溫度一般在25℃為宜。標(biāo)記物每次透析前，須認(rèn)真檢查，防止漏液。
4. 濃的標(biāo)記物相當(dāng)穩(wěn)定，常加入30～40％甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數(shù)周。已配制的使用液應(yīng)在12小時(shí)內(nèi)用完。切忌反復(fù)凍融。