熒光免疫技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。Coons等于1941年首次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)（fluorescentantibodytechnique）。
熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有專供TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。
　　由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難。近年來發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用。
　有關(guān)熒光的基本知識
一、熒光現(xiàn)象
（一）熒光的產(chǎn)生
　　一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。
　　熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。
　　可以引起發(fā)熒光的能量種類很多，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記。
（二）熒光效率
　　熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。
　　熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）
　　發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān)。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的最大吸收峰波長，且測定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時，得到的熒光強度也最大。
（三）熒光的猝滅
　　熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進行得當(dāng)復(fù)染，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示。
二、熒光物質(zhì)
（一）熒光色素
　　許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：
　　1．異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490495nm，最大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：
　　有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用最廣泛的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。
　　2．四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精和丙酮。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：
　　最大吸收光波長為570nm，最大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。
　　3．四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：
　　最大吸引光波長為550nm，最大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧�。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。
（二）其他熒光物質(zhì)
　　1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基苯乙酸等。
　　2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3 ）、鋱（Tb3 ）、鈰（Ce3 ）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3 應(yīng)用最廣。Eu3 螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，最適合用于分辨熒光免疫測定。
免疫學(xué)基本常識：抗原、抗體及單克隆抗體
　 眾所周知，人或動物可以依靠自身的能力抵御某些疾病的侵襲，也有一些疾病可以通過機體自身調(diào)控而自愈，這是因為機體內(nèi)部存在一個免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)是由中樞免疫組織（骨髓、胸腺、消化系統(tǒng)免疫組織）和外周淋巴組織（淋巴結(jié)和脾臟）的免疫活性細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞），以及由它們產(chǎn)生的多種淋巴因子和抗體所組成。免疫系統(tǒng)對外來物質(zhì)產(chǎn)生一系列反應(yīng)的過程稱為免疫，而這種反應(yīng)本身則稱為免疫應(yīng)答。能夠在機體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)稱為抗原，免疫應(yīng)答的結(jié)果則是刺激機體產(chǎn)生與抗原相對應(yīng)的特異性抗體和引起細(xì)胞免疫。
由于免疫應(yīng)答同時取決于機體，而不僅是進入機體的物質(zhì)，所以抗原的定義是相對的。由此，按照免疫應(yīng)答的效果可以將抗原分為完全抗原和半抗原：完全抗原是指能夠直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的一類物質(zhì)。完全抗原的分子量都大于5000，其化學(xué)成分多為蛋白質(zhì)或脂多糖，其它如脂蛋白，糖蛋白，多糖體，多肽，核酸等也都是完全抗原。半抗原能與抗體特異性結(jié)合，但不能激發(fā)機體產(chǎn)生抗體，必須與蛋白質(zhì)（載體）結(jié)合后進入機體，才能產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。大分子的半抗原在體外能與對應(yīng)的抗體結(jié)合發(fā)生可見反應(yīng)（凝集、沉淀），小分子的半抗原能與對應(yīng)抗體結(jié)合而不出現(xiàn)可見反應(yīng)。此外，抗原還可以按照自身的物質(zhì)屬性分為可溶性（毒素、異種蛋白）或顆粒性（細(xì)菌、細(xì)胞）抗原，或按臨床意義分為外源性和內(nèi)源性抗原。
抗體是在抗原刺激下機體免疫應(yīng)答的產(chǎn)物。所有抗體都具有與抗原特異性結(jié)合的能力。抗體的化學(xué)本質(zhì)是免疫球蛋白即γ－球蛋白。不過只有當(dāng)免疫球蛋白針對已知抗原時，才能夠稱這種免疫球蛋白為抗體。免疫球蛋白屬于結(jié)構(gòu)牢固的分子物質(zhì)，可以經(jīng)受較大變化的環(huán)境作用，諸如56℃加溫，在室溫下較長時期的貯藏，短期高或低pH處理，甚至與去污劑或尿素接觸后仍保持其抗體活性。
抗體活性是指與抗原特異性結(jié)合的能力，即二者之間的特殊親合力。兩者非共價鍵結(jié)合，結(jié)合的力包括氫鍵，靜電力，范德華力和疏水結(jié)合力�？贵w抗原之間的反應(yīng)是可逆的，在適宜的條件下仍可解離而性質(zhì)不變。
機體內(nèi)約有1億種不同的B淋巴細(xì)胞，每個獨立的B淋巴細(xì)胞只能接受一種抗原的刺激從而形成分泌一種抗體的能力，因此特異性是免疫應(yīng)答的特有標(biāo)志。如常識所見，麻疹患者愈后即獲得對麻疹的終生免疫，而這并不形成對天花的免疫�？贵w抗原特異性結(jié)合的本質(zhì)是抗原決定簇與抗體結(jié)合簇的專一適配性，抗原決定簇是指抗原分子上專有的化學(xué)基因，可以決定其刺激機體所產(chǎn)生抗體的特異性�？乖瓫Q定簇與其相對應(yīng)的抗體結(jié)合簇立體構(gòu)型完全相適應(yīng)。一個抗原分子可帶有多個不同的決定簇�？乖�分子量愈大，決定簇數(shù)量愈多。決定簇數(shù)目代表抗原分子的價。抗體結(jié)合簇是在抗體分子上與對應(yīng)的抗原決定簇發(fā)生特異性結(jié)合的部位，位于Ig分子的抗原結(jié)合分段（V段）上，由重鏈和輕鏈的一部分可變區(qū)構(gòu)成。其特異性由氨基酸排列順序決定，約包括5～15個氨基酸。每個單體免疫球蛋白分子如IgG有2個結(jié)合簇，IgA是二聚體，有4個結(jié)合簇，IgM是五聚體所以有10個結(jié)合簇。(但是，事情并不是絕對的。一種抗體除與相對應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外，也有可能與化學(xué)結(jié)構(gòu)部分相似的其它抗原發(fā)生反應(yīng)，這就是通常所說的交叉反應(yīng)。交叉反應(yīng)可能由于兩種抗原有共同的決定簇，或由于兩者的抗原決定簇雖然不完全相同，但在立體化學(xué)結(jié)構(gòu)上密切相關(guān)，導(dǎo)致一種抗原能與另一種抗原的對應(yīng)抗體結(jié)合。)
正常情況下，抗體與抗原在機體內(nèi)結(jié)合后，可以被吞噬、排泄而將抗原清除。如果這種抗原屬于外源性致病抗原（細(xì)菌、病毒、毒素），可以由此達(dá)到殺滅或削弱抗原危害的目的。對于內(nèi)源性抗原，如已經(jīng)衰退、損傷或突變的異常細(xì)胞，也能被及時排除，實現(xiàn)機體自身的免疫調(diào)控。當(dāng)然，在異常情況下，抗體抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物將損傷組織、細(xì)胞，引起花粉過敏一類的變態(tài)反應(yīng)或免疫性疾病等不良后果。
不過長期以來所謂特異性免疫血清抗體，不論是從人還是從動物獲得的，也不論是主動獲得還是被動獲得的，實際上都是有許多種具有不同特性的抗體所組成的混合抗體。這是因為，進入機體的抗原往往帶有若干個抗原決定簇。此外，不同個體對同一抗原決定簇的反應(yīng)并不相同，即使同一個體不同時間接受抗原刺激后產(chǎn)生的反應(yīng)也不完全一致。由于人們無法將體內(nèi)已受抗原刺激的各種不同的B淋巴細(xì)胞克隆區(qū)分開，即使在體外能將它們分成單細(xì)胞，也無法讓其繼續(xù)生長，增殖并分泌抗體。因此，用常規(guī)免疫方法制備的免疫血清抗體只能是數(shù)目眾多的單克隆抗體的混合物，現(xiàn)在，一般稱其為多克隆抗體（PcAb）。這種多克隆抗體存在特異性差、效價低、數(shù)量有限、動物間個體差異大，難以重復(fù)制備等固有缺陷，許多場合下使用時難盡人意。
1975年，英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)研究室的Kohler和Milstein合作發(fā)表了題為“分泌預(yù)定特異性抗體的融合細(xì)胞的持續(xù)培養(yǎng)”的著名論文（Nature,256:495,1975）。他們將已適應(yīng)于體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞與綿羊紅細(xì)胞免疫小鼠脾細(xì)胞（B淋巴細(xì)胞）進行融合，發(fā)現(xiàn)融合形成的雜交瘤細(xì)胞具有雙親細(xì)胞的特征：即像骨髓瘤細(xì)胞一樣在體外培養(yǎng)中能夠無限地快速增殖，又能持續(xù)地分泌特異性抗體，通過克隆化可使雜交細(xì)胞成為單純的細(xì)胞系，由此單克隆系就可以獲得結(jié)構(gòu)與各種特性完全相同的高純度抗體，即單克隆抗體（McAb）。上述方法創(chuàng)立了一項具有劃時代意義的新技術(shù)－利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生單克隆抗體。這一技術(shù)的創(chuàng)立和迅速推廣，為所有需要制備和使用抗體的研究領(lǐng)域提供了全新的手段和制劑，促進了生命科學(xué)諸學(xué)科的發(fā)展。兩位科學(xué)家也由于這一杰出貢獻(xiàn)榮獲1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎。
黃曲霉毒素B1是一種二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)�的衍生物，分子量�?12，屬于半抗原，不能直接誘導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。因此我們的工作首先是將黃曲霉毒素B1與載體蛋白連接，合成為完全抗原，以后的研究則基本上采用了前述雜交瘤－單克隆抗體技術(shù)的經(jīng)典方法：動物免疫→免疫脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合→細(xì)胞篩選→用有限稀釋法分離出可分泌特異性抗體的單個細(xì)胞，再經(jīng)過克隆化培養(yǎng)建立雜交瘤細(xì)胞株并制備出大量單克隆抗體，從而在此基礎(chǔ)上最終建立了黃曲霉毒素B1（AFB1）的免疫檢測方法。
免疫標(biāo)記法
（一） 熒光免疫法：
原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點。
以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物。最后根據(jù)熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。
　 傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。
（二） 放射免疫法
放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗原，競爭性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原—抗體復(fù)合物與無放射性的抗原—抗體復(fù)合物，并有過剩的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對未標(biāo)記的待測抗原進行定量。
RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準(zhǔn)確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應(yīng)，使用方便。
(三) 　酶聯(lián)免疫法(ELISA)
ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標(biāo)準(zhǔn)或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg／L，線性范圍達(dá)1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關(guān)性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標(biāo)本的檢測，不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。
以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復(fù)合物。接著加入酶標(biāo)二抗，形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過產(chǎn)物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。
（四）偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法
利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。
（五）時間分辨熒光免疫分析
時間分辨熒光免疫分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。
(六) 解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?br />解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―issociation Enhanced Lanthanide FluoroimmunoassayDELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?