分光光度計是利用物質(zhì)對光的選擇性吸收進(jìn)行物質(zhì)的定性或定量分析的儀器,在各行各業(yè)得到了廣泛應(yīng)用,主要用于物質(zhì)純度檢查、定量分析、物質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒別等?蓽y量結(jié)果總會出現(xiàn)可接受或不可接受的誤差,誤差來源于測量過程的各個方面,我認(rèn)為主要來源于儀器本身性能和測量條件的選擇兩個方面。
比耳定律成立的前提條件是人射光是單色光,但是精度再高的儀器,即使是雙單色器的分光光度計,也只能獲得近乎單色的光,無法獲得純單色光,它仍然含有狹窄光通帶,具有復(fù)色光的性質(zhì)。而復(fù)色光會導(dǎo)致比耳定律的正或負(fù)偏離。
固定狹縫的紫外分光光度計光譜帶寬一般為1nm或2nm,可調(diào)狹縫的可以做到0.Inm;可見分光光度計帶寬6nm、snm,甚至十幾納米。光譜帶寬應(yīng)該是越小越好,但是隨著光譜分辨率的提高,儀器的靈敏度降低,所以選擇儀器時要綜合考慮各種條件的影響。當(dāng)溶液濃度較小且單色光較純時,可近似認(rèn)為符合比耳定律。
雜散光是指進(jìn)人檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的其他波長組分,它是光譜測量中誤差的主要來源。產(chǎn)生原因有:分光光度計的色散元件、反射鏡、透鏡及單色器內(nèi)壁灰塵等。在分光光度計工作波段邊緣波長處,由于單色器透光率、光源輻射強(qiáng)度、檢測器靈敏度都較低,雜散光的影響更為顯著。雜散光限制儀器的分析上限可引起嚴(yán)重的測量誤差,實(shí)際工作中,在定量分析時,一般在吸收峰或其附近處測量樣品吸光度,如果在分析波長處含有雜散光,這時樣品的透光率較小,而雜散光大部分透過,使測量吸光度低于真實(shí)吸光度。
儀器噪聲也是儀器的一個重要指標(biāo),它表征儀器做稀溶液的能力。是疊加在待測量的分析信號中的不需要的信號,掃描100%T和0%T線,可觀察到分光光度計的絕對噪聲水平,如果儀器噪聲較大,會掩蓋較小的測量信號,一般用噪音的二倍來表示儀器的靈敏度。
樣品的每一個值都是在一定的波長下測得的,如果波長誤差很大,測出的值肯定不準(zhǔn)。吸光度準(zhǔn)確度也是用戶對儀器的直接要求,更應(yīng)引起足夠的重視。國家計量檢定規(guī)程規(guī)定雙光束紫外可見分光光度計透射比準(zhǔn)確度為A級士0.6%,B級土1.0%。
分光光度計的測量實(shí)際上是以通過參比池的光強(qiáng)度作為人射光強(qiáng)度來測定試樣的吸光度,先調(diào)節(jié)儀器使透過參比池溶液的吸光度為零,然后讓同一束光通過樣品,使得吸光度比較真實(shí)地反映待測物質(zhì)的濃度,所以參比溶液的選擇非常重要。如果僅有待測物質(zhì)與顯色劑的反應(yīng)產(chǎn)物有吸收,可用純?nèi)軇┗蛘麴s水作參比溶液。如果顯色劑有顏色,并在測定波長下有吸收,則用顯色劑溶液作參比溶液,所加人顯色劑及其它試劑的量,與試樣中的加入量應(yīng)一致。如果樣品中其它組分本身的顏色對測定有干擾,而所用顯色劑沒顏色,則用不加顯色劑的樣品溶液作參比液。
正確選擇合適的溶劑,對提高分析的準(zhǔn)確度起重要作用。為減小溶劑中雜質(zhì)的影響,應(yīng)選擇高純度的溶劑;溶劑應(yīng)不與待測物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng);待測物在溶劑中要有一定的溶解度;在測定的波長范圍內(nèi),溶劑本身沒有吸收,注意常用溶劑的zui短可用波長;當(dāng)用揮發(fā)性大的溶劑時,測量過程中吸收池應(yīng)加蓋。
當(dāng)用分光光度計對溶液進(jìn)行測定時,首先需要選擇合適的測量波長。選擇的依據(jù)是該被測溶液的吸收曲線。在一般情況下,我們總是選擇最大吸收波長作為測量波長,這樣可以提高靈敏度。而在有些情況下最大吸收峰很尖銳、吸收過大或附近有干擾存在,就不能選最大吸收波長,而必須在保證有一定靈敏度的情況下,選擇吸收曲線中的其它波長進(jìn)行測定(曲線較平坦處對應(yīng)的波長),以消除干擾。繪制吸收曲線是正確選擇波長的有效手段和方法。
試樣在不同吸光度時,濃度的相對誤差不同,一般選擇A在0.2-0.8之間,濃度相對誤差較小,可以通過改變吸收池厚度、檢測波長或待測溶液濃度,使吸光度讀數(shù)在適宜范圍內(nèi)。
狹縫寬度不僅影響光譜的純度,也影響吸光度值,在定量分析時,為了得到足夠的測量信號,應(yīng)采用較大狹縫。在定性分析時,為了提高分辨率,應(yīng)采用較小狹縫,以獲得精細(xì)的光譜結(jié)構(gòu)。
吸收池的規(guī)格應(yīng)根據(jù)被測溶液顏色深淺來確定,一般是被測溶液顏色深時選光程短的,顏色淺時選光程長的,同一實(shí)驗使用同一規(guī)格同一套吸收池。在定量測量之前需要對吸收池作校正和配對工作,吸收池不匹配時,對測量產(chǎn)生誤差,吸收池方向不同,透光率亦有差異,使用時應(yīng)注意方向。比色皿毛玻璃一面的上端有一個箭頭,應(yīng)與光路保持一致。另外,使用時,不要把溶液注得太滿,以防在推動比色皿架時溶液溢出皿外。如透光壁外有溶液存在,要擦干再測,否則將產(chǎn)生誤差。
溫度對溶液顏色的深淺和吸光度都有影響,溫度升高,紫外一可見光譜吸收向短波方向移動。故在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定樣品時,應(yīng)保持溫度一致,通常在室溫條件下進(jìn)行。
由于分光光度計引起的測量總誤差除來自儀器自身性能、測量條件外,還來自于分析過程的各個步驟,如試樣處理、分離富集等,可能由于化學(xué)操作引起待測組分的損失和雜質(zhì)的引人。所以出現(xiàn)不可接受的測量誤差時要從多方面分析。
儀器的正確使用和保養(yǎng)也很重要,我們應(yīng)該做到以下幾點(diǎn):堅持標(biāo)準(zhǔn)溶液現(xiàn)用現(xiàn)配,不使用過期溶液;比色皿應(yīng)保持清潔、干燥,禁止用硬物碰擦透明表面;防止儀器振動,影響測量穩(wěn)定性;在開機(jī)狀態(tài),不測量時,應(yīng)打開樣品池門,延長光電傳感器壽命;樣品集中測量,避免開機(jī)次數(shù),延長光源壽命;一旦停機(jī),則應(yīng)待燈冷卻后再重新啟動,并預(yù)熱15min左右再使用;要經(jīng)常更換儀器的干燥劑,防止光學(xué)元件和光電傳感器受潮生霉;儀器搬動或更換重要部件后,要重新進(jìn)行性能確認(rèn),以保證測量結(jié)果的準(zhǔn)確。