1、學習并掌握食品中菌落總數測定方法和原理。
2、了解菌落總數測定在對被樣品進行衛(wèi)生學評價中的意義 。

1、菌落總數

食品檢樣經過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時等）培養(yǎng)后，所得每mL(g)檢樣中形成的微生物菌落總數。

一定條件包括培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時間、pH、是否需要氧氣等。在GB 4789.2-2022的培養(yǎng)條件下所得結果，只包括一群在平板計數瓊脂上生長發(fā)育的嗜中溫需氧菌或兼性厭氧菌的菌落總數。

菌落總數并不表示實際中的所有細菌總數，也不能區(qū)分其中細菌的種類，只包括一群在計數平板瓊脂中生長發(fā)育、嗜中溫的需氧和兼性厭氧的菌落總數，所以有時被稱為雜菌數，需氧菌數等。

2、菌落總數測定的衛(wèi)生學意義：

（1）食品本身的新鮮程度

（2）加工、貯存運輸過程中是否受到污染--衛(wèi)生質量

（3）衛(wèi)生學指標：食品中細菌菌落總數越多，則食品含有致病菌的可能性越大，食品質量越差；菌落總數越小，則食品含有致病菌的可能性越小。須配合大腸菌群和致病菌的檢驗，才能對食品做出較全面的評價。

3、2022版國家標準的主要變動：

三、流程：

拍擊式均質

方便：只需購置一次性無菌均質袋，無須提前準備無菌容器；省去手工操作。

快捷：1-2分鐘內幫您完成均質工作。

科學：均質過程不會產生高溫。但是不適合均質堅硬樣品，如魚骨。 

稀釋液——磷酸鹽緩沖液or生理鹽水。

如果樣品pH較低，建議使用磷酸鹽緩沖液，以免影響培養(yǎng)基的凝膠強度。

培養(yǎng)基——平板計數瓊脂。

關于均質器使用效果和對檢測結果的影響，有不同的報道：

1、不同食品樣品采用不同的均質方法，測試結果不同。

2、不同的均質方式對金黃色葡萄球菌和霉菌、酵母菌的檢測的影響也不同。

（二）、樣品稀釋：

1、樣品的稀釋。

2、制備好樣品勻液后,用1mol/L氫氧化鈉或1 mol/L鹽酸調節(jié)pH至6.6~7.2。

3、接種。

4、培養(yǎng)。

瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。

（三）、培養(yǎng)注意事項：

根據食品衛(wèi)生標準要求和對樣品污染情況的估計，選擇1~3個稀釋度。加入樣品時要注意外來的污染。

培養(yǎng)基傾注的溫度與厚度是實驗正確與否的關鍵。（傾注的溫度：一般46~50℃，溫度過高會造成已受損傷的菌細胞死亡。厚度：直徑9cm的平皿一般要求15~20mL培養(yǎng)基，若培養(yǎng)基太薄，在培養(yǎng)過程中可能因水分蒸發(fā)而影響細菌的生長）。

為防止細菌增殖及產生片狀菌落，在加入樣液后，應在15min內傾注培養(yǎng)基。檢樣與培養(yǎng)基混勻時，可先向一個方向旋轉，然后再向相反方向旋轉。旋轉中應防止混合物濺到皿邊的上方。

1、培養(yǎng)基凝固后，應在盡快將平皿翻轉培養(yǎng)，保持瓊脂表面干燥，盡量避免菌落蔓延生長，影響計數。

2、為控制污染，在實驗過程中，應在工作臺上打開一塊瓊脂平板，其暴露時間應與檢樣從制備、稀釋到加入平皿時所暴露的最長時間相當，然后與檢樣一同培養(yǎng)，以了解檢樣在操作過程中有無受到來自外界的污染。培養(yǎng)溫度:每種不同樣品中的細菌都有一定的生理特性，培養(yǎng)時應用不同的營養(yǎng)條件及生理條件可能得出不同的結果，因而應根據檢測標準的要求選擇適當的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間。

3、食品：36±１℃，48±2h 。

4、飲用水：36±１℃，48h 。

5、水產品：30±１℃，72±3h。(36℃培養(yǎng)和30℃培養(yǎng)結果差別較大，同樣水產品48h結果和72h也有差別。

（四）、對照試驗的要點：

1、檢樣的稀釋液中往往帶有食品顆粒，在這種情況下，為避免與細菌菌落混淆，可作一檢樣對照，不經培養(yǎng)，置4℃環(huán)境放置，在計數時用于對照。

2、或可選用TTC營養(yǎng)瓊脂作培養(yǎng)基。

菌落計數的要點：

1、如果高稀釋度平板上的菌落數比低稀釋度平板上的菌落數高，則說明檢驗過程中可能出現差錯或樣品中含抑菌物質，這樣的結果不可用于結果報告。

2、如果平板上出現鏈狀菌落，菌落間沒有明顯的界限，這可能是瓊脂與檢樣混勻時，一個細菌塊被分散所造成的。一條鏈作為一個菌落計。若培養(yǎng)過程中遭遇昆蟲侵入，在昆蟲爬行過的地方也會出現鏈狀菌落，也不應分開計數。

3、如果平板上菌落太多，不能計數時，不能用多不可計作報告。應在最高稀釋度平板上任意選取2個1cm²的面積，計算菌落數，除2求出每cm²面積內平均菌落數，乘以63.6(皿底面積cm²數)（這樣說明選擇的稀釋度不合適，生產企業(yè)自檢自控可以這樣報告，正式的報告不能這樣報告）。

4、如果檢樣是微生物類制劑（酸牛奶、酵母制酸性飲料等），在進行菌落計數時應將有關微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入檢樣的菌落總數內作報告。 

5、每個樣品從開始稀釋到傾注最后一個平板的時間不得超過15min，目的是為了使菌落能在平板上均勻分布，否則，時間放長了，樣液可能由于干燥而貼在平板上，傾注瓊脂后不易搖開，容易產生片狀菌落，影響菌落計數。另外，瓊脂凝固后不要在室溫長時間放置，應及時將平皿倒置培養(yǎng)，可避免菌落的蔓延生長。

6、檢驗過程中應用稀釋液做空白對照，用以判定稀釋液、培養(yǎng)基、平皿或吸管可能存在的污染。同時，檢驗過程中應在工作臺上打開一塊空白的平板計數瓊脂，其暴露時間應與檢驗時間相當，以了解檢樣在檢驗過程中有無受到來自空氣的污染。

7、檢樣稀釋液有時帶有食品顆粒，為避免與細菌發(fā)生混淆，可以作一檢樣稀釋液與平板計數瓊脂混合的平皿，不經培養(yǎng)，于4℃冰箱放置，以便在計數時用作對照。另外也可以在已熔化而保溫在45℃水浴內的平板計數瓊脂中，按100ml加1mL0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培養(yǎng)后食品顆粒不變色，細菌為紅色。