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取 材
取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理檢驗的結(jié)果是不會令人滿意的。
一、取材工具：取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，不應(yīng)使用有鉤鑷子或血管鉗等手術(shù)器械鑷取標(biāo)本，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來困難或?qū)е洛e診，漏診。
二、標(biāo)本的選�。簯�(yīng)選擇病變或可疑病變的組織。必要時選取病變與正常組織交界處。切取標(biāo)本的原則是求準(zhǔn)而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過24x24mm2為佳，厚度以3—5mm為度，過大過厚會影響對標(biāo)本的固定，另方面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。
1.了使組織切片的結(jié)構(gòu)清楚，取材要及時，組織塊必須爭取時間及時固定。組織的固定以愈新鮮愈好。
2.取材時對大體標(biāo)本（肉眼標(biāo)本）繪制圖象，進行仔細(xì)描述。包括形狀、大小，硬度，顏色，病灶（或可疑病變）部位等。對所取的組織應(yīng)定位編號。
3.切取各組織塊時，切勿擠壓損傷，對典型或具有教學(xué)和科研價值的肉眼標(biāo)本，
不能因取材而對標(biāo)本造成人為的“病變”。腸粘膜組織上沾有少量糞便，也不應(yīng)以手拭去或以水洗去。
4.下的組織塊應(yīng)盡量防止其彎曲扭轉(zhuǎn)，如胃腸等組織，應(yīng)先平展于草紙上粘著以后，慢慢地放入固定液中（故應(yīng)在動手剖驗之前做好準(zhǔn)備工作）。固定液的量要充足，應(yīng)為固定組織的10倍。
5.組織采取應(yīng)在正常與病灶交界之處。組織形狀最好為方形或長方形狀，這樣有利于制片。切不可以形狀定位，組織厚薄要均勻。因為組織塊的厚度決定固定的速度，要充分滿足它在一定時間內(nèi)全部達(dá)到適宜的固定。如組織厚薄不均，在脫水時將會引起標(biāo)本變形或 曲，而影響制片。在典型病變部位不妨多切數(shù)塊，以備日后添制教學(xué)切片或研究的需要。
6.微量標(biāo)本和易碎標(biāo)本，為避免破損或丟失應(yīng)以紗布包裹，但包裹前紗布必須浸濕，以免標(biāo)本粘附紗布上。
7.各組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)，如腎臟組織包括皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分。在有漿膜的臟器（如胃等）組織塊中，要至少有一塊帶有漿膜。
8.組織內(nèi)的鈣化病灶或骨質(zhì)，應(yīng)在充分固定之后進行脫鈣，組織內(nèi)的非病理性異物應(yīng)予剔除。
9. 標(biāo)本上（組織塊）附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應(yīng)在不影響病理診斷的原則下，盡量剝?nèi)セ蚯谐�，以利制片�?br /> 10.組織塊的固定時間不宜過長或過短，不同的固定液，固定時間有所不同，固定后的組織需要用流水沖洗，再進行脫水制片。
11.切取鏡檢組織塊后，可將剩余的組織放入70%灑精中保存，這樣有利于日后再取材切片時的細(xì)胞染色。
組織的固定
一、固定的意義
固定是指將各種組織浸入防腐劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為不溶性。固定的作用即是用一種方法將組織盡可能保持在它原來的形態(tài)，且能適于某些研究程序。
凡是需要制作作病理檢驗標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本，還是制作巨體標(biāo)本，首先必須固定。在制作切片過程中，固定最為重要的步驟，一張優(yōu)秀的組織學(xué)切片是建立在適當(dāng)而完全的固定基礎(chǔ)之上的。固定不良在以后制片的任何階段皆不能補救。因此制片的優(yōu)劣首先取決于最初固定適當(dāng)與否。
重要的是，被固定組織在動物死后或從活體切取后要盡可能立即固定。及時的取材給迅速固定提供了先決條件。如果不迅速固定，造成固定不良，將導(dǎo)致染色不良后果。組織的良好固定，應(yīng)該是一次性的；某些固定劑還具有助染的作用，可使細(xì)胞各部易于著色。固定不良的組織，即使進行補充固定也起不到改善染色的效果。
二、固定的目的和效果
固定組織的目的是設(shè)法得到接近正常生命狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有人說“形態(tài)學(xué)的美是良好固定產(chǎn)物”，這說明固定的特殊重要作用。
1、抑制自溶和腐�。�
組織的固定能保持細(xì)胞與生活時的形態(tài)相似。因為當(dāng)機體生命活動停止、或局部器官、組織割離機體之后，組織細(xì)胞的代謝功能即行喪失，新鮮組織如果不經(jīng)固定，任意放置，由于細(xì)胞內(nèi)酶對蛋白質(zhì)的分解，以及細(xì)胞的孳生等各種因素的作用，則易因細(xì)胞繁殖而致組織腐爛。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸后脫離細(xì)胞而引起組織的自溶。
2、保存：
細(xì)胞經(jīng)過固定，不但可以防止自溶和細(xì)菌性腐敗，而且能沉淀或凝固組織內(nèi)的各種成份和病理代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)，脂及脂蛋白、脂肪、糖類、色素，其它碳水化合物，無機成份，微生物等都可以經(jīng)過固定而保存下來，并在制片過程中不為其他試劑 溶解破壞。
3、硬化：
固定劑的硬化作用能使柔軟組織（如腦）的質(zhì)地變硬而易于操作。
4、膠質(zhì)物體的固化：
固定能使細(xì)胞正常的半液體狀（溶膠）變?yōu)椴荒苣孓D(zhuǎn)的固體狀（凝膠）粘度。
5、肉眼鑒別：
固定可將各種細(xì)胞和組織成分的析光率作不同程度的改變，增強組織的析光指數(shù)，這樣能使各種染色成份較之未固定時更容易辨認(rèn)。
6、對染色的影響：
某些固定劑尚具有一定的媒染作用而增進染色（如苦味酸對于染色的媒染作用）可使細(xì)胞各種部位易于著色，所以組織固定后有利于制片染色和在顯微鏡下的觀察。此外，固定劑有時也會影響染色效果，導(dǎo)致著色效果不理想（如福爾馬林對水溶猩紅S染色的影響）。
7、滲透和固定：
固定還可以使組織和細(xì)胞的各種滲透壓不再發(fā)生改變，在制片時就能在最大范圍內(nèi)保持組織和細(xì)胞的原來形態(tài)。
三、固定的方法及注意事項：
為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時間要充足，固定液量要足夠。
固定組織時，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的10~15倍以上。標(biāo)本瓶應(yīng)選擇瓶口較大的為宜，這樣便于固定后的標(biāo)本經(jīng)小口瓶硬塞進去，這樣不僅不利于標(biāo)本易于取出，還可能造成人為擠壓組織而致形態(tài)變化，對大件的標(biāo)本應(yīng)按巨檢常規(guī)切片后放于容器固定。
組織固定的時間要足夠，根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時間應(yīng)有所不同，組織越大越厚，固定時間應(yīng)越長，反之。一般4—12小時或更長。在溫箱內(nèi)將固定液稍加溫，可使固定作用加快而縮短固定時間。
固定組織時，應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的5—10倍，最少也不應(yīng)于五倍。標(biāo)本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液對標(biāo)本的滲入。如標(biāo)本塊多時，固定時不應(yīng)重疊。不要先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿，形成固定不均勻之弊。新鮮標(biāo)本應(yīng)及時固定，否則或因組織陳舊，或因固定不當(dāng)，而使組織原有結(jié)構(gòu)消失而影響觀察。
標(biāo)本經(jīng)固定后，應(yīng)及時制作切片，如不能及時制片，而該固定液又不能作為保存液時，應(yīng)改換適當(dāng)?shù)谋４嬉骸?br /> 在配制混合液時，應(yīng)了解每種固定劑的理化性質(zhì)，氧化劑不能與還原劑混合，以免引起化學(xué)反應(yīng)，失去固定作用。
對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶反應(yīng)等組織的固定，要求較一般嚴(yán)格，組織的大小，固定的時間，溫度的適當(dāng)都應(yīng)慎重考慮，尤其是對于酶反應(yīng)的固定液，一般都要置于冰箱，在低溫的條件下進行固定。固定不好，是得不到滿意的切片和合乎標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)效果的。
任何固定液對人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。
四、固定劑的選擇
理想的固定劑應(yīng)該具備下列幾種性能：
1、滲透性強：固定劑必須能迅速滲入組織，這樣組織內(nèi)各種成分才能盡快地被固定在原位置，而不致彌散。
2、組織在固定液的作用下，不應(yīng)發(fā)生顯著的收縮和膨脹現(xiàn)象。實際上經(jīng)過固定后的組織，由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝固或沉淀，必然導(dǎo)致組織出現(xiàn)不同程度的收縮或膨脹。因此，良好的固定劑應(yīng)盡量減少組織發(fā)生這類變化。
3、固定劑應(yīng)該有利組織切片和染色，這其中含有兩種意義；
（1）固定劑對固定后的組織應(yīng)有利于染色劑的染色。例如：重鉻酸鉀對于類脂質(zhì)具有一定媒染作用；中性福爾馬林比一般福爾馬林所固定組織更優(yōu)于核的染色。
(2)固定劑能將組織或細(xì)胞中某些必須觀察的成分予充分固定而保存下來，以便染色。例如：酸可以滲入脂類物質(zhì)使其固定下來而不至在制片過程中為酒精和二甲苯溶解或較少地溶解，并可用石蠟包埋進行切片。糖原的證明，則宜使用非水溶性固定劑如無水酒精、Camoy氏固定液等。
4、固定液應(yīng)該同時也是一種較好的保存液。
實際上，沒有哪一種固定液，無任是單一固定液或混合固定液都能夠完全達(dá)到上述要求。各種固定劑性能和作用都不盡相同，因此，對標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?br />
五、固定劑的種類
組織制片技術(shù)上所使用的固定劑種類繁多，性能各有不同，有的為氧化劑，有的為還原劑；有的呈酸性，有的呈堿性；有的滲透力強，有的滲透力弱；有些易使組織收縮，有些則使組織發(fā)生輕微膨脹現(xiàn)象。一般地說，單一固定劑要想使組織固定后達(dá)到某種特殊染色要求是比較困難的。因此，在標(biāo)本固定中常使用兩種以上成分（固定劑）的混合固定液。
六、用做固定劑的試劑
1、單一固定劑：
僅由一種化學(xué)物質(zhì)加水溶解后用以固定標(biāo)本的固定液叫單一固定液。常用單一固定試劑有甲醛，灑精，冰醋酸，苦味酸，重鉻酸鉀，餓酸，氧化汞 ，丙酮等。除福爾馬林，酒精和丙酮常用作單一固定劑外，其它多作混合液中的一種成分。
甲醛formaldeloyde (H·CHO)
甲醛是一種氣體，約有40%重量溶于水。這是一種還原劑，頗易揮發(fā)，這種飽和溶液稱為甲醛溶液；其商品名叫福爾馬林。
10%福爾馬林的組成系；
甲醛溶液（福爾馬林） 10ml
水 90 ml
甲醛是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時又是一種良好別的標(biāo)本保存液。經(jīng)它固定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強，固定均勻，能增加組織的韌性，組織 縮輕微，硬性大于酒精。
福爾馬林主要是由甲醛的聚合形式構(gòu)成，然而聚合形式的固定效果低于單體形式構(gòu)成的10%福爾馬林，為阻止在放置一定時間的重聚作用，一般將溶液的PH值調(diào)節(jié)至中性或偏堿性。
甲醛與蛋白質(zhì)是在分子間的交聯(lián)上起反應(yīng)，最終產(chǎn)生一種不溶性產(chǎn)物。它經(jīng)過絡(luò)合交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，能較好地保存脂類；對肝糖也有固定作用，但必須及時固定及時處理，以免產(chǎn)生水解。
甲醛當(dāng)長期貯存，特別于寒冷氣候下，自行分解，可變混濁，有白色沉淀物，這種沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一種聚合形式（加熱可重新分解成甲醛）。商品福爾馬林用甲醇阻止聚合作用。有時由于溶液不純或甲醛氧化產(chǎn)生的甲酸成分使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使標(biāo)本嗜染酸性、嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞核的嗜酸性染色。因此，在備用的甲醛中宜放入小量的碳酸鎂或碳酸鈉作為中和劑。如果每100毫升的福爾馬林固定液中加入5ml的吡啶，則可調(diào)整PH為7。不過，這些方法不能永久保持其PH值；欲望使其長期保持中性，則需以磷酸緩沖液作溶劑進行配制。其配制方法如下：
10%福爾馬林 1000ml
磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ） 4g
磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ） 6.5g
固定小的組織塊數(shù)小時即可達(dá)到固定要求。如需要快速固定時，可加溫到70～80℃，經(jīng)過10分鐘即可達(dá)到固定要求。在甲醛溶液中短時固定的標(biāo)本，沖洗時間在10分鐘至2小時即可，但固定時間較長的標(biāo)本需要較長時間的流水沖洗。一般要沖洗24小時，甚至延長48小時，否則，由于甲酸的沉淀將會影響染色的結(jié)果。
甲醛能保存脂肪和類脂體，對染色體，線粒體，高爾基體，具有良好的固定作用。
經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織內(nèi)�？沙霈F(xiàn)棕黑色的福爾馬林色素顆粒，這種色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲與含鐵血黃素加以區(qū)別，可用普魯士蘭反應(yīng)進行鑒別。福爾馬林色素不含有鐵，因此，福爾馬林色素呈陰性反應(yīng)，用中性或微堿性福爾馬林固定的效果能顯著增加對鐵離子的檢出速度且可完全避免福爾馬林色素的形成。此外也可以使用其他試劑以浸洗方法除去福爾馬林色素的沉淀，如：
（1）苦味酸飽和酒精（90%）溶液浸洗30分鐘后經(jīng)70%酒精再水洗后進行染色。
（2）什端氏（Schriade）法：
70%酒精 200ml
28%氨水 1ml
將石蠟切片在脫蠟以后放于上述液體中30分鐘，再用流水沖洗，而后染色。若甲醛產(chǎn)生的色素沉淀仍未被其洗去，則可在Schriade氏液中延長時間。此法并不損害組織。
(3)費羅氏（Verocay）法:
80%酒精 100ml
1%KOH 1ml
將切片在脫蠟至80%酒精后，浸入上液10分鐘，再流水沖洗5分鐘，入80%酒精之后水洗染色。
福爾馬林固定的標(biāo)本，經(jīng)酒精脫水收縮較大，是其缺點。
酒精（C2 H5 OH）
可單獨用作固定液；亦可作混合固定液，因為酒精（乙醇）是一種還原劑，所以不可與鉻酸，重鉻酸鉀或鋨酸等氧化劑相混合使用。在氧量不足時酒精易氧化成乙醛；氧量充足則能生成酯酸，所以在正常情況下，酒精是偏酸性試劑。
酒精為常用的有機溶劑，能溶解多種有機物，高濃度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，對肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖經(jīng)酒精固定成水溶性狀態(tài)，因此，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本如果固定后用水洗滌，則核著色欠佳，肝糖也將被水解。作為一種脂溶劑，濃度在50%以上的酒精可溶解脂肪和類酯體，因此，對脂類的證明，高爾基氏體，線粒體等染色不宜使用酒精作固定劑。
酒精還可溶解血紅蛋白和損害多數(shù)其他色素，因此，如果證明組織蛋白的色素時也不宜以酒精作為固定劑。
濃酒精有較大的收縮力，被它固定的組織收縮顯著，表面發(fā)硬，因而酒精較難滲入到組織中去，組織必須用酒精固定時宜先用80%的酒精固定數(shù)小時，然后再換95%酒精，這樣可以避免組織過度收縮，因此它的穿透力緩慢且與組織長期接觸能使之硬化，如需要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。
酒精既有固定作用，又有脫水作用，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本不需洗滌，可用較高濃度酒精直接進行脫水，也可暫存于70%酒精中。
醋酸（CH3 COOH）
純醋酸為無色，具有強烈刺激性的酸性液體，溫度低于17℃時呈固體狀，形成冰樣結(jié)晶體。所以，一般稱為冰醋酸。
醋酸因使膠原纖維腫脹，故不能單獨使用；但在混合固定液中有抗其它試劑使細(xì)胞皺縮的作用。因此，醋酸常同酒精配制成為混合固定液來抵消經(jīng)過固定所引起組織的高度收縮和硬化的作用。
醋酸可與水，酒精等溶劑相混合。一般使用濃度為0.3～5%，以5%為備用液。用醋酸固定后的組織不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。醋酸的滲透性很強，一般較小的組織塊只須1小時即可。
醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色質(zhì)固定很快，是染色質(zhì)良好的固定液。對蛋白質(zhì)具有保存作用，對脂類、糖不產(chǎn)生影響，高濃度醋酸則可溶解脂肪及類脂，并使線粒體和高爾基體被破壞或變形。所以，一般配制含醋酸的混合液時，其濃度都不超過5%。
苦味酸（C6 H2 (NO2 )3 OH）
苦味酸是一種具毒性的黃色結(jié)晶體，味苦，在空氣中干燥時有爆炸性，故需保濕保存，最好是儲存在一層水下。一般情況下，制片室將苦味酸制成飽和溶液作為常備用液，通常固定的濃度是飽和液，其飽和度為0.9%~1.2%�？辔端崛苡诰凭�，二甲苯，固定后的組織經(jīng)酒精脫水即可。苦味酸也是一種良好的組織染色劑，經(jīng)苦味酸固定劑固定的組織作三色染色可使顏色對比鮮艷。
苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)，并與其結(jié)合形成苦味酸鹽，遇水時，其中有的部分可溶與水，因此在一般情況下，組織經(jīng)苦味酸或含有苦味酸的固定劑固定后，這種水溶性苦味酸鹽在與水接觸前需先經(jīng)酒精處理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在酒精內(nèi)加上少量碳酸鋰或氨水即可被洗去�；蛘呤遣唤�(jīng)水洗，直接投入70%酒精脫水。在脫水過程中，苦味酸可被各級酒精溶解洗去。即使不能全部洗去，亦不妨礙染色，脫水酒精雖被染黃，但亦不失其脫水效果。
通�？辔端岢恋砑t細(xì)胞，可移走鐵離子，特別是僅少量存在時可使RNA抵抗核糖核酸酶的消化。
重鉻酸鉀(K2 Cr2 O7 )
重鉻酸鉀為一種橘紅色有毒性的塊狀結(jié)晶體，溶于水，不溶于酒精，為一種強氧化劑。所以其水溶液不應(yīng)與酒精，福爾馬林等還原劑相混合使用。在某些情況下，同福爾馬林混合固定標(biāo)本時，只能在使用前相混合，過久即失去固定作用。經(jīng)重鉻酸鉀固定后的組織應(yīng)及時進行水洗脫水，否則標(biāo)本變硬脆化，不易制成切片。如不能當(dāng)即制作切片，可將標(biāo)本保存于福爾馬林液內(nèi)。
重鉻酸鉀對蛋白質(zhì)的結(jié)合作用像福爾馬林一樣，固定胞漿不易引起沉淀作用。但在溶液中加入醋酸，PH為3.75時，會使染色質(zhì)和細(xì)胞漿硬化，使之產(chǎn)生鉻酸，才能使蛋白質(zhì)呈網(wǎng)狀沉淀。重鉻酸鉀對細(xì)胞質(zhì)，染色質(zhì)固定良好，但染色質(zhì)則被溶解。未酸化的重鉻酸鉀雖不能沉淀蛋白質(zhì)，但可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄�，還可以保護磷脂類，亦能固定類脂物，使其不溶解于脂溶劑。因此，可以固定高爾基氏體和線粒體。
重鉻酸鉀不是糖的固定液，用重鉻酸鉀（或鉻酸）固定的組織幾乎完全不會發(fā)生收縮，但經(jīng)酒精脫水時，則收縮明顯。所以在脫水之前，組織需用流水沖洗16－12小時。如把含鉻組織直接轉(zhuǎn)移到酒精內(nèi)，會形成一種非溶性低氧化物而不易除去。
重鉻酸鉀有溶解染色質(zhì)的缺點，一般備用液為5％水溶液，固定液使用濃度為1％－3％水溶液。
鉻酸（CrO3 ）
為暗紅色或帶暗紫色的塊狀結(jié)晶，具有強酸性及腐蝕性，劇毒，易潮解，為強氧化劑，應(yīng)置于暗處。它是Orth氏液或ZenRer氏液等復(fù)合固定劑中的一種成分，不應(yīng)同酒精、福爾馬林等還原劑混合使用。鉻酸與乙醇，乙醚少許接觸即可引起爆炸。
鉻酸可沉淀所有的蛋白質(zhì)，使不溶于水，并可保存糖類。鉻酸水解DNA系將其戊糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N醛；亦可將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槿�。因此DNA和糖類不需經(jīng)過常規(guī)PAS或Feulgen反應(yīng)的預(yù)先處理即與Schiff試劑呈陽性染色。
鉻酸的滲透力較低，對標(biāo)本收縮輕微，經(jīng)鉻酸固定劑固定的組織像用重鉻酸鉀固定一樣需徹底水洗，將組織中鉻酸全部洗去，否則在脫水過程中，鉻酸與酒精作用生成氧化鉻的沉淀，使組織脆化，且不易于組織的著色。鉻酸適合固定的濃度為0.5%～1%。
四氧化鋨（OsO4 ）
為微黃色結(jié)晶，通常密裝于安瓿內(nèi)出售，為強氧化劑，一般認(rèn)為它使未飽和鍵氧化。對飽和脂肪不起反應(yīng)，未飽和脂類可還原OsO4 ，易氧化為黑色氫氧化物，溶液呈中性，揮發(fā)性強，在操作四氧化鋨時應(yīng)小心，因其氣體有刺激性，會引起結(jié)膜炎。遇熱和光時易還原，故應(yīng)貯于冷暗處。平時溶液密閉有色瓶中，并置于冰箱內(nèi)。
四氧化鋨是脂肪和類脂質(zhì)的固定液，用以顯示脂類（例如髓脂類）。能使單個細(xì)胞或小組織的微細(xì)構(gòu)造得以極好地保存，因此幾乎是用于電子顯微術(shù)最佳固定劑。組織經(jīng)固定后，脂肪，類脂呈黑色，微溶于二甲苯及酒精，脫水后最好以苯作透明劑。
四氧化鋨的滲透力弱。組織塊如過2－3厘米厚度則穿透不良和不均。所有含四氧化鋨固定劑的固定作用皆很不均勻；固定不良的組織切片表現(xiàn)周圍有一圈過度固定的暗色區(qū)帶；中心為固定不足致使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)不清的區(qū)域。有些成分變暗是由于無色的OsO4 轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏衔颫sO4·5H2 O形式。
四氧化鋨常與鉻酸，醋酸，重鉻酸鉀等混合使用，固定后的組織需經(jīng)流水沖洗，否則在脫水酒精中易被還原產(chǎn)生沉淀，不利于核著色，在每10毫升溶液中內(nèi)加入1滴飽和氯化汞水溶液有助于制止還原作用。
氯化汞（又名升汞或二氯化汞HgCL2 ）
氯化汞為白色粉末或針狀結(jié)晶，后者為化學(xué)純品，易升華，能溶于水和酒精。一般固定用其飽和溶液。
氯化汞是一種能迅速透入并使組織硬化的蛋白沉淀劑。通常像別的金屬離子那樣，它與蛋白質(zhì)的酸基以及核蛋白的磷酸基相結(jié)合，亦特異地與氫硫基起反應(yīng)。因而經(jīng)Hg固定后的蛋白質(zhì)不溶于水，大多數(shù)蛋白反應(yīng)可被利用�？上�，它的透入速度于最初幾毫米后就急驟降低，因此組織塊厚度如超過5毫米常使外圍過度固定致堅硬而中心固定不足仍柔軟，只宜固定薄片組織。由于此缺點加之使組織收縮劇烈，很少單獨使用；當(dāng)與拮抗此缺點的試劑如醋酸，福爾馬林，重鉻酸鉀等結(jié)合使用時，氯化汞仍是很多優(yōu)良常規(guī)固定劑的一種成分。用氯化汞固定的組織使染色特別對胞漿著色比較鮮麗。
凡用含氯化汞的固定劑固定的組織如超過規(guī)定時間會使組織過度硬化，而難切薄片。組織內(nèi)常存有汞鹽，切片時能損傷切片刀，所以在脫水前應(yīng)予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘（0.5%）浸洗，再進行充分的沖洗或以70%酒精洗后進行脫水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗數(shù)分鐘，再以5%硫代硫酸鈉漂洗，水洗后進行染色。
氯化汞常備溶液為飽和（約7%）水溶液，固定用濃度常為5%水溶液。用升汞飽和液固定組織時，臨時須加5%冰醋酸。固定2－3mm厚的組織塊須經(jīng)6－18小時，然后用水洗24小時，再保存于80%酒精中。
氯化汞腐蝕金屬，混有此試劑的固定液不能使用金屬容器盛裝或用金屬鑷子夾持。氯化汞有劇毒，應(yīng)妥善保管。
固定劑的選擇取決于研究工作當(dāng)時和下一步的需要，在選擇混合固定劑時，應(yīng)注意各種試劑的平衡，如使組織收縮的試劑可配以使組織膨脹的試劑，滲透力弱的可與滲透力強的混合使用。但是，氧化劑原則上不與還原劑混用，如需要時，只能在使用前臨時混合。一種混合固定劑內(nèi)不宜有兩種以上的鹽類，以免產(chǎn)生復(fù)鹽影響對組織的固定，如氧化納和氯化鈉同時應(yīng)用時，常將氯化鈉改用硫酸鈉。技術(shù)工作者和病理工作者都應(yīng)了解各種固定劑的性能。固定液的選擇恰當(dāng)，才能獲得滿意的制片結(jié)果。
混合固定液的種類很多，本章內(nèi)所述的固定劑皆是較常用的，特殊染色所需的固定劑皆列在相應(yīng)的標(biāo)題下。
Miiller氏液
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
蒸餾 水加至 100ml
此液固定作用緩慢，但頗均勻，收縮亦小。多用于媒染和硬化神經(jīng)組織，在這種固定溶液中，重鉻酸鉀未經(jīng)酸化，所以對染色質(zhì)無固定作用。不適用于一般細(xì)胞學(xué)染色。除用于骨骼標(biāo)本外，此液是一種不常用的固定劑。固定時間數(shù)天至數(shù)周，在固定過程中，需要每日更換新液并置暗處，固定后的組織用流水沖洗，再放入酒精中脫水。
Orth氏液（Mullr氏液＋福爾馬林）
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
福爾馬林 10ml
蒸餾 水 加至 100ml
一般以Mullr氏液為備用液，用前以9份Mullr氏液加1份福爾馬林混合而成，因為重鉻酸鉀是氧化劑，福爾馬林為還原劑，混合后久放即失去固定作用。
固定0.5厘米的標(biāo)本塊約需3－4日，每日需更換新液，標(biāo)本固定后要充分水洗，然后進行脫水包埋。如固定過久，標(biāo)本變脆，顏色由棕黃轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏瑒t不能制作切片，標(biāo)本經(jīng)固定后如不能及時制片時，應(yīng)將標(biāo)本保存于福爾馬林內(nèi)或70%酒精中。
Orth氏液對染色質(zhì)，線粒體有較好的固定效果。硫酸鈉在固定液中有助于滲透作用，在一般情況下，可省去不用。
Zenker氏液（以Muller液為基液加入氯化汞在臨用前再加醋酸混合而成）
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
氯化汞 5.0g
蒸餾水 加至 100ml
冰醋酸（臨用時加入） 5ml
Muller液加入醋酸后則不能貯存，未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存較久。此液加入冰醋酸后，與重鉻酸鉀作用生成鉻酸，是蛋白質(zhì)的良好固定劑，其穿透力迅速而均勻硬化組織能力強，經(jīng)它固定后的標(biāo)本利于鹽基性染色劑著色，胞核和胞漿染色頗為清晰，是一種優(yōu)良的常規(guī)固定劑。
Zenker氏固定液中含有兩種蛋白質(zhì)和三種染色質(zhì)的固定劑：
福爾馬林（40%甲醛液） 25ml
冰醋酸 5ml
此固定液保存性良好，滲透速度快，穿透力迅速而均勻，且很少引起收縮，不使組織變硬和變脆，固定后的組織用三色染色法著色鮮艷絢麗，過量苦味酸使組織呈黃色，但并不妨礙染色，毋須洗凈除去。
此液也是皮膚組織較好的固定液，它可以軟化表皮不使其變硬變脆。利于切片，對蛋白質(zhì)核酸有較好的固定作用，一般固定時間為數(shù)小時至一日。
Carrnoy氏固定液
配方：無水酒精 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
此液穿透力非常塊、固定力強，對核固定良好，并可保存糖原也用于糖類的固定。于脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固定。一般組織固定2－3小時后即可直接投入95%酒精和純酒精中進行脫水，因此也可作快速固定的固定劑，厚度2－9毫米的小塊組織僅需15分鐘即可，外檢胸腹水經(jīng)過離心沉淀后，將沉淀物用Carrnoy氏液固定可制作石蠟切片。
醋酸－酒精－福爾馬林混合固定液
配方：福爾馬林 10ml
冰醋酸 5ml
70%酒精 85ml
這種混合固定液通常簡稱“AAF”固定液。使用較廣泛，配制時一般可以酒精作為溶劑，然后加入福爾馬林，醋酸。酒精可因組織種類不同而采用不同的濃度，在常規(guī)切片中，我們常采用濃度為95%酒精。
此液對糖原的固定佳良，就是說在蛋白質(zhì)成分完全固定之前可以防止糖類溶解，加入醋酸以保證蛋白質(zhì)的固定，由于酒精和福爾馬林二者皆為迅速穿透的試劑，這是一種相當(dāng)好的快速固定劑，對臨床外檢工作特別有利，福爾馬林對組織染色 效果較好，醋酸可以防止酒精而引起的收縮。常溫下，5毫米厚的組織固定4小時即可，加溫（60℃）條件下，一般組織半小時內(nèi)可固定良好，固定后組織直接放入95%酒精中脫水。
AAF固定液的缺點是組織固定后對細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)有一定破壞作用，而對免疫組織化學(xué)染色有一定影響（詳見免疫組織化學(xué)技術(shù)一章）。
其它常用固定液配方
10%甲醛生理鹽水液
配方：福爾馬林 100ml
氯化鈉 9.0g
蒸餾水 900ml
Gendre液
配方：苦味酸飽和于95%酒精溶液 80ml
福爾馬林 15ml
冰醋酸 5ml
用此液在室溫下3－4小時即可使糖原固定良好。
緩沖福爾馬林液
配方：福爾馬林 10ml
磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ·2H2 O） 0.4g
磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ） 0.65g
蒸餾水 100ml
緩沖福爾馬林固定劑具有能較好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)，適于免疫組織化學(xué)染色和電鏡觀察，并且可較長時間保存組織（半年至一年）而又不影響制片和染色。是近年來越來越受到重視的固定劑。
大體標(biāo)本的處理和固定
解剖所得的臟器標(biāo)本，可提供臨床病理討論及教學(xué)和科研之用，除對有典型的病變臟器制成標(biāo)本外，對有重要病變的臟器亦應(yīng)固定保存，條件允許可將全部臟器切成需要的大小保留。
通常所用的固定液是10%甲醛（即福爾馬林）水溶液（市售甲醛溶液用水稀釋1：9）。這樣既可使組織內(nèi)的蛋白和脂類等成分凝固，又可使組織不致腐爛。為了保存組織內(nèi)的各種水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸鹽結(jié)晶等，應(yīng)在剖驗當(dāng)時將部分臟器切成組織塊放入純酒精液固定，切不可著水。
只有細(xì)心且有計劃地進行尸體剖檢，并在切除器官后仔細(xì)處理才能獲得良好地陳列標(biāo)本。剖檢過程中的粗心和草率，很容易破壞一個有價值的標(biāo)本。因為今天的常見病明天會成為罕見病例，為此重要的是保持這些病理標(biāo)本原有的形態(tài)和色澤。有時外科手術(shù) 摘除的標(biāo)本，如經(jīng)適當(dāng)處理也可以成為最好的陳列標(biāo)本。
常規(guī)的福爾馬林固定后，大體標(biāo)本常呈灰褐色，用下述方法擬可保存大體標(biāo)本的色澤，使之更接近自然色彩。
配方：甲醛 20ml
硝酸鉀 3g
醋酸鉀 3g
生理鹽水 加至 100ml
固定時間視標(biāo)本的大小而定，一般24－72小時。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后再放入下述保存液中長期保存。
甘油 20ml
醋酸鉀 4g
麝香草酚 0.2g
蒸餾水 加至 100ml（PH＝8）
陳列標(biāo)本的固定
一.為供日后臨床病理討論、教學(xué)和研究用的標(biāo)本，必須將有關(guān)主要病變的臟器和其它繼發(fā)變化的臟器一并保留，這樣就保持了各臟器病變的聯(lián)系性和整體性。
二.將每一尸體的內(nèi)臟放入一個較大的玻璃缸內(nèi)。這種園缸應(yīng)有緊密的玻璃蓋，使之不漏氣。缸內(nèi)先裝半缸10%甲醛液，再將需要保留的各臟器放入，一定要浸在固定劑內(nèi)，若聽任露在液面外的組織變干，則會造成一塊永久的暗色區(qū)。
三.各標(biāo)本如肝、脾和腎等應(yīng)具有一光滑平整地切面（須以鋒利的長刃刀一次切出）。輕放在缸內(nèi)，以免彎曲變形，缸內(nèi)切不可多裝標(biāo)本，特別是新鮮的軟標(biāo)本和對有教學(xué)價值的標(biāo)本要分別固定，以免擠壓、防止固定不足和變形而失去原有的特征。缸內(nèi)固定液的量是標(biāo)本體積的4－5倍。一般實質(zhì)性臟器制作標(biāo)本時，其厚度宜在1.5厘米左右，過厚則固定液不易滲透入內(nèi)，過薄則易變形翹起。
四.肺臟標(biāo)本比重較輕，易漂浮在液面，可用薄層脫脂棉花覆蓋其表面、借以棉花纖維的虹吸現(xiàn)象，可不斷地浸濕標(biāo)本。在有條件的情況下，為保證充分固定，應(yīng)盡可能向標(biāo)本內(nèi)灌注固定劑。
五.標(biāo)本放入固定液12小時后應(yīng)加以翻轉(zhuǎn)，以使標(biāo)本與缸底或缸壁接觸部分能很好浸透固定液。
六.具有空腔的臟器（如大、小腸）膜組織（如胸膜、腹膜等），皮膚等則應(yīng)在剪開后用扣針將其邊沿釘在硬紙板上，標(biāo)本朝下浸到固定液內(nèi)，以保持病變的形態(tài)，使用的扣針需防銹（也可用玻璃，竹簽或不銹鋼針）以免污染標(biāo)本。
七.囊腔組織如果沒有打開可用注射器注入固定液使之充盈；如已打開則需填入浸有固定劑的脫脂棉以保持其自然狀態(tài)。
八.被膽汁污染或含膽汁的標(biāo)本，必須分別固定貯存，否則會污染別的標(biāo)本。
九.標(biāo)本的外觀、標(biāo)簽和目錄也同樣重要，大體標(biāo)本的編號最好用布條，用碳素墨水書寫解剖號碼，然后將布條浸漬溶化的石蠟，冷卻后將標(biāo)簽系于標(biāo)本上或投入缸內(nèi)，標(biāo)本缸外面亦須貼上解剖號碼，以便隨時取驗。
十.大體標(biāo)本的保存和管理必須予以重視，應(yīng)定期加入甲醛溶液以補充平時之揮發(fā)。液體內(nèi)混和少量麝香草酚，作為防霉劑。平時也勤加管理，以防止發(fā)霉和標(biāo)本腐爛。除有明確病變需要保留的標(biāo)本外，對廢舊標(biāo)本亦須妥善處理。一般相隔3－6個月后，集中裝于草包內(nèi)焚化或深埋。
脫 鈣
組織里存有鈣鹽可妨礙用常規(guī)方法制作良好切片。骨組織及鈣化病灶，經(jīng)過固定后，必先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進行常規(guī)切片。如脫鈣不全則切片易撕開或碎裂并損傷切片刀刃。脫去鈣鹽的過程――稱為脫鈣。脫鈣時應(yīng)注意：
1.骨組織固定24小時后，鋸下不超過0.5mm厚的薄骨片，再以10%福爾馬林固定后進行脫鈣。（未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織約大三倍）。骨組織過厚則需延長脫鈣時間，長時間浸于強酸影響切片染色效果。
2.在不影響診斷的條件下，應(yīng)將骨組織周圍的軟組織全部剝?nèi)ァＨ绻衅康脑谟谟^察骨髓病變或骨組織腫瘤，最好除去一部分正常的致密的骨組織，以利于脫鈣和制片。
3.脫鈣前最好先將骨組織進行脫脂。
4.脫鈣要徹底，脫水應(yīng)充分，在脫水過程中，要注意不使其過度硬化。
脫鈣劑
優(yōu)質(zhì)脫鈣劑的標(biāo)準(zhǔn)是：
（a） 完全脫鈣。
（b） 不損傷組織細(xì)胞或纖維。
（c） 不妨礙以后的染色技術(shù)。
（d） 適當(dāng)?shù)拿撯}速度。
一、強酸脫鈣劑
1.含甲酸脫鈣液
Gooding和Stewart氏液（甲酸－福爾馬林液）
配方：甲酸 5－25ml
福爾馬林 5ml
蒸餾水 加至 100ml
5%的甲酸是一種良好的常規(guī)脫鈣劑，速度適當(dāng)，組織損害小。當(dāng)甲酸成分增至25%則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當(dāng)保護組織不受酸損害，但應(yīng)切記，增加脫鈣速度只能靠犧牲細(xì)胞微細(xì)構(gòu)造來獲得。
根據(jù)組織的厚度和鈣化程度，在5％甲酸液內(nèi)2－4天可完全脫鈣，橫切的肋骨需36－48小時。
2.含鹽酸脫鈣液
Von Ebner氏液
配方：濃鹽酸 15ml
氯化鈉 7.5ml
蒸餾水 加至 100ml
鹽酸脫鈣易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好，牙齒脫鈣時鹽酸可增至10－20%。脫鈣時，每日應(yīng)加鹽酸（0.5%）直至完成脫鈣，橫切的人肋骨（5毫米厚度）于36－72小時內(nèi)脫鈣。
3． 硝酸脫鈣液
是最常用的脫鈣劑，用硝酸作脫鈣液的缺點是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產(chǎn)生顏色即迅速影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色反應(yīng)。在硝酸內(nèi)加入0.1％尿素可以防止變黃而使之無色，但尿素僅有暫時作用，一旦硝酸顯淡黃時需要加入。
福爾馬林－硝酸液（Clayden氏液）
配方：福爾馬林 5ml
硝酸（比重1.41） 7.5－15ml
蒸餾水 加至 100ml
此處方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸軟作用，這即具有脫鈣作用，又具有固定作用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好脫鈣時間可直接脫水，不影響染色效果。但最好先洗去硝酸。
橫切人肋骨（5mm）用含7.5％硝酸液于1－2天內(nèi)脫鈣。
硝酸水溶液
配方：硝酸（用0.1尿素穩(wěn)定） 5－10ml
蒸餾水 加至 100ml
此液用作常規(guī)脫鈣劑，作用迅速，對組織不膨脹，對細(xì)胞的保存和染色比前者更好，能適用多種染色技術(shù)，但每日需要更換新鮮溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。
橫切人肋骨（5mm）在12－24小時內(nèi)脫鈣。
二、螯合劑脫鈣
乙二胺四乙酸（EDTA ）是用以脫鈣地螯合劑。為有機化合物，有結(jié)合某些金屬的能力，能結(jié)合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對組織破壞性小，即放置數(shù)月亦不致引起對組織的破壞，對以后大多數(shù)的染色技術(shù)皆可得到滿意結(jié)果。
經(jīng)10%中性福爾馬林鹽固定后，將組織移到50倍用磷酸鹽緩沖劑緩沖至PH值等于7的5.5％EDTA 內(nèi)。
不超過5毫米厚度的小塊組織在此液內(nèi)每4－5天換液一次，更換三次后再每天換液一次以便較準(zhǔn)確的確定脫鈣終點。脫鈣“終點”可用X射線方法或用草酸鹽化學(xué)方法。
完全脫鈣后將組織直接移到70%酒精內(nèi)常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟或火棉膠包埋。
三、脫鈣步驟
1．取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。
2．固定：再以10%福爾馬林固定2天。
3．將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。
4．流水沖洗24小時（除酸）。
5．進行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。
四、鑒定脫鈣是否徹底
確定脫鈣“終點”三種方法：
1. 最常用的是最簡單的方法――針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時，說明組織基本上脫鈣完全，否則應(yīng)繼續(xù)脫鈣�？拷M織的柔軟性測驗脫鈣作用靠不住，而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會造成組織損傷。
2．用X射線檢查：看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)。
3．用化學(xué)實驗檢查：
取5ml脫鈣液用2M的NaOH（氫氧化鈉）調(diào)整至中性，再加5％草酸鈉或草酸銨1ml，液體混濁表示有鈣質(zhì)。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質(zhì)。
組織中仍有鈣質(zhì)時，一定量的鈣離子會溶于脫鈣液中，游離的鈣會干擾脫鈣作用的完成。顯然，應(yīng)在每次試驗時完全更換，再試驗中必須經(jīng)過2－3小時間隔讓鈣溶解。
五．酸的中和
脫鈣后水洗24小時，目的是除去組織中經(jīng)無機酸浸漬后過多的酸，以免影響染色。再沖洗前應(yīng)將組織用一種堿處理以使之脫酸呈中性，可用5％硫酸鉀或硫酸鈉處理過夜。（否則會引起組織膨脹）但直接轉(zhuǎn)移到稀酒精（70％）內(nèi)過12－18小時換液2次，再繼續(xù)脫水，經(jīng)無水酒精，氯仿透明，石蠟包埋，切片，整個過程其酸已全部除去，在多數(shù)情況下不僅不膨脹且對染色反應(yīng)能有所改善。因此不沖洗對染色也沒大礙，只是脫水劑被酸化。
組織的沖洗
組織經(jīng)過固定后，脫水之前應(yīng)進行沖洗，將組織內(nèi)的固定液洗干凈，否則殘留組織內(nèi)的固定液有礙制片和染色，而有些固定液則可在組織中繼續(xù)起到脆化組織的作用，以至于損壞組織，給制片工作帶來不利。在沖洗時，沖洗劑的選擇應(yīng)依固定液的種類和性質(zhì)而有所不同。
沖洗時應(yīng)注意以下事項：
1.水溶性的固定劑：需用流水沖洗。
2.酒精溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。
3.含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。
4.含有升汞固定劑：組織經(jīng)固定后應(yīng)在沖洗劑－水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)汞的沉淀。
含有鉻酸的固定劑：組織在沖洗時最好置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬化而影響制片。
取材是制作切片程序中的首要步驟，取材不當(dāng)，將直接影響病理診斷和科研工作的效果。組織標(biāo)本的選用非常重要，不能隨意的切取組織來制作組織切片，否則病理檢驗的結(jié)果是不會令人滿意的。
一、取材工具：取材刀具必須鋒利。切取標(biāo)本不應(yīng)該擠壓和揉擦，不應(yīng)使用有鉤鑷子或血管鉗等手術(shù)器械鑷取標(biāo)本，以免損害組織造成人為組織變化，給診斷帶來困難或?qū)е洛e診，漏診。
二、標(biāo)本的選�。簯�(yīng)選擇病變或可疑病變的組織。必要時選取病變與正常組織交界處。切取標(biāo)本的原則是求準(zhǔn)而不是求量多，所以切取組織宜小不宜大，以不超過24x24mm2為佳，厚度以3—5mm為度，過大過厚會影響對標(biāo)本的固定，另方面也影響切片的制作。特殊目的者應(yīng)屬例外。
1.了使組織切片的結(jié)構(gòu)清楚，取材要及時，組織塊必須爭取時間及時固定。組織的固定以愈新鮮愈好。
2.取材時對大體標(biāo)本（肉眼標(biāo)本）繪制圖象，進行仔細(xì)描述。包括形狀、大小，硬度，顏色，病灶（或可疑病變）部位等。對所取的組織應(yīng)定位編號。
3.切取各組織塊時，切勿擠壓損傷，對典型或具有教學(xué)和科研價值的肉眼標(biāo)本，
不能因取材而對標(biāo)本造成人為的“病變”。腸粘膜組織上沾有少量糞便，也不應(yīng)以手拭去或以水洗去。
4.下的組織塊應(yīng)盡量防止其彎曲扭轉(zhuǎn)，如胃腸等組織，應(yīng)先平展于草紙上粘著以后，慢慢地放入固定液中（故應(yīng)在動手剖驗之前做好準(zhǔn)備工作）。固定液的量要充足，應(yīng)為固定組織的10倍。
5.組織采取應(yīng)在正常與病灶交界之處。組織形狀最好為方形或長方形狀，這樣有利于制片。切不可以形狀定位，組織厚薄要均勻。因為組織塊的厚度決定固定的速度，要充分滿足它在一定時間內(nèi)全部達(dá)到適宜的固定。如組織厚薄不均，在脫水時將會引起標(biāo)本變形或 曲，而影響制片。在典型病變部位不妨多切數(shù)塊，以備日后添制教學(xué)切片或研究的需要。
6.微量標(biāo)本和易碎標(biāo)本，為避免破損或丟失應(yīng)以紗布包裹，但包裹前紗布必須浸濕，以免標(biāo)本粘附紗布上。
7.各組織塊應(yīng)包括各臟器的重要結(jié)構(gòu)，如腎臟組織包括皮質(zhì)部分和髓質(zhì)部分。在有漿膜的臟器（如胃等）組織塊中，要至少有一塊帶有漿膜。
8.組織內(nèi)的鈣化病灶或骨質(zhì)，應(yīng)在充分固定之后進行脫鈣，組織內(nèi)的非病理性異物應(yīng)予剔除。
9. 標(biāo)本上（組織塊）附著的軟組織如脂肪等，如屬非病變成分，則應(yīng)在不影響病理診斷的原則下，盡量剝?nèi)セ蚯谐�，以利制片�?br /> 10.組織塊的固定時間不宜過長或過短，不同的固定液，固定時間有所不同，固定后的組織需要用流水沖洗，再進行脫水制片。
11.切取鏡檢組織塊后，可將剩余的組織放入70%灑精中保存，這樣有利于日后再取材切片時的細(xì)胞染色。
組織的固定
一、固定的意義
固定是指將各種組織浸入防腐劑內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)為不溶性。固定的作用即是用一種方法將組織盡可能保持在它原來的形態(tài)，且能適于某些研究程序。
凡是需要制作作病理檢驗標(biāo)本的各種組織，無論是制作切片標(biāo)本，還是制作巨體標(biāo)本，首先必須固定。在制作切片過程中，固定最為重要的步驟，一張優(yōu)秀的組織學(xué)切片是建立在適當(dāng)而完全的固定基礎(chǔ)之上的。固定不良在以后制片的任何階段皆不能補救。因此制片的優(yōu)劣首先取決于最初固定適當(dāng)與否。
重要的是，被固定組織在動物死后或從活體切取后要盡可能立即固定。及時的取材給迅速固定提供了先決條件。如果不迅速固定，造成固定不良，將導(dǎo)致染色不良后果。組織的良好固定，應(yīng)該是一次性的；某些固定劑還具有助染的作用，可使細(xì)胞各部易于著色。固定不良的組織，即使進行補充固定也起不到改善染色的效果。
二、固定的目的和效果
固定組織的目的是設(shè)法得到接近正常生命狀態(tài)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，有人說“形態(tài)學(xué)的美是良好固定產(chǎn)物”，這說明固定的特殊重要作用。
1、抑制自溶和腐�。�
組織的固定能保持細(xì)胞與生活時的形態(tài)相似。因為當(dāng)機體生命活動停止、或局部器官、組織割離機體之后，組織細(xì)胞的代謝功能即行喪失，新鮮組織如果不經(jīng)固定，任意放置，由于細(xì)胞內(nèi)酶對蛋白質(zhì)的分解，以及細(xì)胞的孳生等各種因素的作用，則易因細(xì)胞繁殖而致組織腐爛。細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分解酶將蛋白質(zhì)分解為氨基酸后脫離細(xì)胞而引起組織的自溶。
2、保存：
細(xì)胞經(jīng)過固定，不但可以防止自溶和細(xì)菌性腐敗，而且能沉淀或凝固組織內(nèi)的各種成份和病理代謝產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)，脂及脂蛋白、脂肪、糖類、色素，其它碳水化合物，無機成份，微生物等都可以經(jīng)過固定而保存下來，并在制片過程中不為其他試劑 溶解破壞。
3、硬化：
固定劑的硬化作用能使柔軟組織（如腦）的質(zhì)地變硬而易于操作。
4、膠質(zhì)物體的固化：
固定能使細(xì)胞正常的半液體狀（溶膠）變?yōu)椴荒苣孓D(zhuǎn)的固體狀（凝膠）粘度。
5、肉眼鑒別：
固定可將各種細(xì)胞和組織成分的析光率作不同程度的改變，增強組織的析光指數(shù)，這樣能使各種染色成份較之未固定時更容易辨認(rèn)。
6、對染色的影響：
某些固定劑尚具有一定的媒染作用而增進染色（如苦味酸對于染色的媒染作用）可使細(xì)胞各種部位易于著色，所以組織固定后有利于制片染色和在顯微鏡下的觀察。此外，固定劑有時也會影響染色效果，導(dǎo)致著色效果不理想（如福爾馬林對水溶猩紅S染色的影響）。
7、滲透和固定：
固定還可以使組織和細(xì)胞的各種滲透壓不再發(fā)生改變，在制片時就能在最大范圍內(nèi)保持組織和細(xì)胞的原來形態(tài)。
三、固定的方法及注意事項：
為使組織固定充分，應(yīng)做到固定容器要合適、固定時間要充足，固定液量要足夠。
固定組織時，應(yīng)選擇合適的容器、一般容器的容積是組織的10~15倍以上。標(biāo)本瓶應(yīng)選擇瓶口較大的為宜，這樣便于固定后的標(biāo)本經(jīng)小口瓶硬塞進去，這樣不僅不利于標(biāo)本易于取出，還可能造成人為擠壓組織而致形態(tài)變化，對大件的標(biāo)本應(yīng)按巨檢常規(guī)切片后放于容器固定。
組織固定的時間要足夠，根據(jù)標(biāo)本體積大小不同，固定時間應(yīng)有所不同，組織越大越厚，固定時間應(yīng)越長，反之。一般4—12小時或更長。在溫箱內(nèi)將固定液稍加溫，可使固定作用加快而縮短固定時間。
固定組織時，應(yīng)該使用足量的固定液，多比少好，一般應(yīng)為組織體積的5—10倍，最少也不應(yīng)于五倍。標(biāo)本最好懸浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液對標(biāo)本的滲入。如標(biāo)本塊多時，固定時不應(yīng)重疊。不要先將標(biāo)本塊放入容器后再注入固定液，以免標(biāo)本貼付于器皿，形成固定不均勻之弊。新鮮標(biāo)本應(yīng)及時固定，否則或因組織陳舊，或因固定不當(dāng)，而使組織原有結(jié)構(gòu)消失而影響觀察。
標(biāo)本經(jīng)固定后，應(yīng)及時制作切片，如不能及時制片，而該固定液又不能作為保存液時，應(yīng)改換適當(dāng)?shù)谋４嬉骸?br /> 在配制混合液時，應(yīng)了解每種固定劑的理化性質(zhì)，氧化劑不能與還原劑混合，以免引起化學(xué)反應(yīng)，失去固定作用。
對于某些需要制作神經(jīng)染色和酶反應(yīng)等組織的固定，要求較一般嚴(yán)格，組織的大小，固定的時間，溫度的適當(dāng)都應(yīng)慎重考慮，尤其是對于酶反應(yīng)的固定液，一般都要置于冰箱，在低溫的條件下進行固定。固定不好，是得不到滿意的切片和合乎標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)效果的。
任何固定液對人體都有損害作用，因此固定液的容器必須密閉，以防揮發(fā)損傷器官和眼睛，忌用手與固定劑直接接觸，以免損傷皮膚。
四、固定劑的選擇
理想的固定劑應(yīng)該具備下列幾種性能：
1、滲透性強：固定劑必須能迅速滲入組織，這樣組織內(nèi)各種成分才能盡快地被固定在原位置，而不致彌散。
2、組織在固定液的作用下，不應(yīng)發(fā)生顯著的收縮和膨脹現(xiàn)象。實際上經(jīng)過固定后的組織，由于蛋白質(zhì)發(fā)生凝固或沉淀，必然導(dǎo)致組織出現(xiàn)不同程度的收縮或膨脹。因此，良好的固定劑應(yīng)盡量減少組織發(fā)生這類變化。
3、固定劑應(yīng)該有利組織切片和染色，這其中含有兩種意義；
（1）固定劑對固定后的組織應(yīng)有利于染色劑的染色。例如：重鉻酸鉀對于類脂質(zhì)具有一定媒染作用；中性福爾馬林比一般福爾馬林所固定組織更優(yōu)于核的染色。
(2)固定劑能將組織或細(xì)胞中某些必須觀察的成分予充分固定而保存下來，以便染色。例如：酸可以滲入脂類物質(zhì)使其固定下來而不至在制片過程中為酒精和二甲苯溶解或較少地溶解，并可用石蠟包埋進行切片。糖原的證明，則宜使用非水溶性固定劑如無水酒精、Camoy氏固定液等。
4、固定液應(yīng)該同時也是一種較好的保存液。
實際上，沒有哪一種固定液，無任是單一固定液或混合固定液都能夠完全達(dá)到上述要求。各種固定劑性能和作用都不盡相同，因此，對標(biāo)本的固定應(yīng)根據(jù)組織的制片目的和要求去選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌?br />
五、固定劑的種類
組織制片技術(shù)上所使用的固定劑種類繁多，性能各有不同，有的為氧化劑，有的為還原劑；有的呈酸性，有的呈堿性；有的滲透力強，有的滲透力弱；有些易使組織收縮，有些則使組織發(fā)生輕微膨脹現(xiàn)象。一般地說，單一固定劑要想使組織固定后達(dá)到某種特殊染色要求是比較困難的。因此，在標(biāo)本固定中常使用兩種以上成分（固定劑）的混合固定液。
六、用做固定劑的試劑
1、單一固定劑：
僅由一種化學(xué)物質(zhì)加水溶解后用以固定標(biāo)本的固定液叫單一固定液。常用單一固定試劑有甲醛，灑精，冰醋酸，苦味酸，重鉻酸鉀，餓酸，氧化汞 ，丙酮等。除福爾馬林，酒精和丙酮常用作單一固定劑外，其它多作混合液中的一種成分。
甲醛formaldeloyde (H·CHO)
甲醛是一種氣體，約有40%重量溶于水。這是一種還原劑，頗易揮發(fā)，這種飽和溶液稱為甲醛溶液；其商品名叫福爾馬林。
10%福爾馬林的組成系；
甲醛溶液（福爾馬林） 10ml
水 90 ml
甲醛是一種使用廣泛、簡便的固定劑，同時又是一種良好別的標(biāo)本保存液。經(jīng)它固定的標(biāo)本，可適應(yīng)一些特殊染色。它的滲透性較強，固定均勻，能增加組織的韌性，組織 縮輕微，硬性大于酒精。
福爾馬林主要是由甲醛的聚合形式構(gòu)成，然而聚合形式的固定效果低于單體形式構(gòu)成的10%福爾馬林，為阻止在放置一定時間的重聚作用，一般將溶液的PH值調(diào)節(jié)至中性或偏堿性。
甲醛與蛋白質(zhì)是在分子間的交聯(lián)上起反應(yīng)，最終產(chǎn)生一種不溶性產(chǎn)物。它經(jīng)過絡(luò)合交聯(lián)，使蛋白質(zhì)固定，能較好地保存脂類；對肝糖也有固定作用，但必須及時固定及時處理，以免產(chǎn)生水解。
甲醛當(dāng)長期貯存，特別于寒冷氣候下，自行分解，可變混濁，有白色沉淀物，這種沉淀即三聚甲醛，是甲醛的一種聚合形式（加熱可重新分解成甲醛）。商品福爾馬林用甲醇阻止聚合作用。有時由于溶液不純或甲醛氧化產(chǎn)生的甲酸成分使溶液呈酸性，酸性的甲醛溶液使標(biāo)本嗜染酸性、嚴(yán)重時可導(dǎo)致細(xì)胞核的嗜酸性染色。因此，在備用的甲醛中宜放入小量的碳酸鎂或碳酸鈉作為中和劑。如果每100毫升的福爾馬林固定液中加入5ml的吡啶，則可調(diào)整PH為7。不過，這些方法不能永久保持其PH值；欲望使其長期保持中性，則需以磷酸緩沖液作溶劑進行配制。其配制方法如下：
10%福爾馬林 1000ml
磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ） 4g
磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ） 6.5g
固定小的組織塊數(shù)小時即可達(dá)到固定要求。如需要快速固定時，可加溫到70～80℃，經(jīng)過10分鐘即可達(dá)到固定要求。在甲醛溶液中短時固定的標(biāo)本，沖洗時間在10分鐘至2小時即可，但固定時間較長的標(biāo)本需要較長時間的流水沖洗。一般要沖洗24小時，甚至延長48小時，否則，由于甲酸的沉淀將會影響染色的結(jié)果。
甲醛能保存脂肪和類脂體，對染色體，線粒體，高爾基體，具有良好的固定作用。
經(jīng)甲醛固定的陳舊組織，尤以多血的肝脾組織內(nèi)�？沙霈F(xiàn)棕黑色的福爾馬林色素顆粒，這種色素不溶于水，酒精及丙酮等，如欲與含鐵血黃素加以區(qū)別，可用普魯士蘭反應(yīng)進行鑒別。福爾馬林色素不含有鐵，因此，福爾馬林色素呈陰性反應(yīng)，用中性或微堿性福爾馬林固定的效果能顯著增加對鐵離子的檢出速度且可完全避免福爾馬林色素的形成。此外也可以使用其他試劑以浸洗方法除去福爾馬林色素的沉淀，如：
（1）苦味酸飽和酒精（90%）溶液浸洗30分鐘后經(jīng)70%酒精再水洗后進行染色。
（2）什端氏（Schriade）法：
70%酒精 200ml
28%氨水 1ml
將石蠟切片在脫蠟以后放于上述液體中30分鐘，再用流水沖洗，而后染色。若甲醛產(chǎn)生的色素沉淀仍未被其洗去，則可在Schriade氏液中延長時間。此法并不損害組織。
(3)費羅氏（Verocay）法:
80%酒精 100ml
1%KOH 1ml
將切片在脫蠟至80%酒精后，浸入上液10分鐘，再流水沖洗5分鐘，入80%酒精之后水洗染色。
福爾馬林固定的標(biāo)本，經(jīng)酒精脫水收縮較大，是其缺點。
酒精（C2 H5 OH）
可單獨用作固定液；亦可作混合固定液，因為酒精（乙醇）是一種還原劑，所以不可與鉻酸，重鉻酸鉀或鋨酸等氧化劑相混合使用。在氧量不足時酒精易氧化成乙醛；氧量充足則能生成酯酸，所以在正常情況下，酒精是偏酸性試劑。
酒精為常用的有機溶劑，能溶解多種有機物，高濃度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白，對肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖經(jīng)酒精固定成水溶性狀態(tài)，因此，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本如果固定后用水洗滌，則核著色欠佳，肝糖也將被水解。作為一種脂溶劑，濃度在50%以上的酒精可溶解脂肪和類酯體，因此，對脂類的證明，高爾基氏體，線粒體等染色不宜使用酒精作固定劑。
酒精還可溶解血紅蛋白和損害多數(shù)其他色素，因此，如果證明組織蛋白的色素時也不宜以酒精作為固定劑。
濃酒精有較大的收縮力，被它固定的組織收縮顯著，表面發(fā)硬，因而酒精較難滲入到組織中去，組織必須用酒精固定時宜先用80%的酒精固定數(shù)小時，然后再換95%酒精，這樣可以避免組織過度收縮，因此它的穿透力緩慢且與組織長期接觸能使之硬化，如需要證明尿酸結(jié)晶和保存糖類，則須用100%酒精固定。
酒精既有固定作用，又有脫水作用，經(jīng)酒精固定的標(biāo)本不需洗滌，可用較高濃度酒精直接進行脫水，也可暫存于70%酒精中。
醋酸（CH3 COOH）
純醋酸為無色，具有強烈刺激性的酸性液體，溫度低于17℃時呈固體狀，形成冰樣結(jié)晶體。所以，一般稱為冰醋酸。
醋酸因使膠原纖維腫脹，故不能單獨使用；但在混合固定液中有抗其它試劑使細(xì)胞皺縮的作用。因此，醋酸常同酒精配制成為混合固定液來抵消經(jīng)過固定所引起組織的高度收縮和硬化的作用。
醋酸可與水，酒精等溶劑相混合。一般使用濃度為0.3～5%，以5%為備用液。用醋酸固定后的組織不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中。醋酸的滲透性很強，一般較小的組織塊只須1小時即可。
醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色質(zhì)固定很快，是染色質(zhì)良好的固定液。對蛋白質(zhì)具有保存作用，對脂類、糖不產(chǎn)生影響，高濃度醋酸則可溶解脂肪及類脂，并使線粒體和高爾基體被破壞或變形。所以，一般配制含醋酸的混合液時，其濃度都不超過5%。
苦味酸（C6 H2 (NO2 )3 OH）
苦味酸是一種具毒性的黃色結(jié)晶體，味苦，在空氣中干燥時有爆炸性，故需保濕保存，最好是儲存在一層水下。一般情況下，制片室將苦味酸制成飽和溶液作為常備用液，通常固定的濃度是飽和液，其飽和度為0.9%~1.2%�？辔端崛苡诰凭�，二甲苯，固定后的組織經(jīng)酒精脫水即可。苦味酸也是一種良好的組織染色劑，經(jīng)苦味酸固定劑固定的組織作三色染色可使顏色對比鮮艷。
苦味酸能沉淀一切蛋白質(zhì)，并與其結(jié)合形成苦味酸鹽，遇水時，其中有的部分可溶與水，因此在一般情況下，組織經(jīng)苦味酸或含有苦味酸的固定劑固定后，這種水溶性苦味酸鹽在與水接觸前需先經(jīng)酒精處理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗，在酒精內(nèi)加上少量碳酸鋰或氨水即可被洗去�；蛘呤遣唤�(jīng)水洗，直接投入70%酒精脫水。在脫水過程中，苦味酸可被各級酒精溶解洗去。即使不能全部洗去，亦不妨礙染色，脫水酒精雖被染黃，但亦不失其脫水效果。
通�？辔端岢恋砑t細(xì)胞，可移走鐵離子，特別是僅少量存在時可使RNA抵抗核糖核酸酶的消化。
重鉻酸鉀(K2 Cr2 O7 )
重鉻酸鉀為一種橘紅色有毒性的塊狀結(jié)晶體，溶于水，不溶于酒精，為一種強氧化劑。所以其水溶液不應(yīng)與酒精，福爾馬林等還原劑相混合使用。在某些情況下，同福爾馬林混合固定標(biāo)本時，只能在使用前相混合，過久即失去固定作用。經(jīng)重鉻酸鉀固定后的組織應(yīng)及時進行水洗脫水，否則標(biāo)本變硬脆化，不易制成切片。如不能當(dāng)即制作切片，可將標(biāo)本保存于福爾馬林液內(nèi)。
重鉻酸鉀對蛋白質(zhì)的結(jié)合作用像福爾馬林一樣，固定胞漿不易引起沉淀作用。但在溶液中加入醋酸，PH為3.75時，會使染色質(zhì)和細(xì)胞漿硬化，使之產(chǎn)生鉻酸，才能使蛋白質(zhì)呈網(wǎng)狀沉淀。重鉻酸鉀對細(xì)胞質(zhì)，染色質(zhì)固定良好，但染色質(zhì)則被溶解。未酸化的重鉻酸鉀雖不能沉淀蛋白質(zhì)，但可使蛋白質(zhì)變?yōu)椴蝗苄�，還可以保護磷脂類，亦能固定類脂物，使其不溶解于脂溶劑。因此，可以固定高爾基氏體和線粒體。
重鉻酸鉀不是糖的固定液，用重鉻酸鉀（或鉻酸）固定的組織幾乎完全不會發(fā)生收縮，但經(jīng)酒精脫水時，則收縮明顯。所以在脫水之前，組織需用流水沖洗16－12小時。如把含鉻組織直接轉(zhuǎn)移到酒精內(nèi)，會形成一種非溶性低氧化物而不易除去。
重鉻酸鉀有溶解染色質(zhì)的缺點，一般備用液為5％水溶液，固定液使用濃度為1％－3％水溶液。
鉻酸（CrO3 ）
為暗紅色或帶暗紫色的塊狀結(jié)晶，具有強酸性及腐蝕性，劇毒，易潮解，為強氧化劑，應(yīng)置于暗處。它是Orth氏液或ZenRer氏液等復(fù)合固定劑中的一種成分，不應(yīng)同酒精、福爾馬林等還原劑混合使用。鉻酸與乙醇，乙醚少許接觸即可引起爆炸。
鉻酸可沉淀所有的蛋白質(zhì)，使不溶于水，并可保存糖類。鉻酸水解DNA系將其戊糖轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N醛；亦可將糖類轉(zhuǎn)變?yōu)槿�。因此DNA和糖類不需經(jīng)過常規(guī)PAS或Feulgen反應(yīng)的預(yù)先處理即與Schiff試劑呈陽性染色。
鉻酸的滲透力較低，對標(biāo)本收縮輕微，經(jīng)鉻酸固定劑固定的組織像用重鉻酸鉀固定一樣需徹底水洗，將組織中鉻酸全部洗去，否則在脫水過程中，鉻酸與酒精作用生成氧化鉻的沉淀，使組織脆化，且不易于組織的著色。鉻酸適合固定的濃度為0.5%～1%。
四氧化鋨（OsO4 ）
為微黃色結(jié)晶，通常密裝于安瓿內(nèi)出售，為強氧化劑，一般認(rèn)為它使未飽和鍵氧化。對飽和脂肪不起反應(yīng)，未飽和脂類可還原OsO4 ，易氧化為黑色氫氧化物，溶液呈中性，揮發(fā)性強，在操作四氧化鋨時應(yīng)小心，因其氣體有刺激性，會引起結(jié)膜炎。遇熱和光時易還原，故應(yīng)貯于冷暗處。平時溶液密閉有色瓶中，并置于冰箱內(nèi)。
四氧化鋨是脂肪和類脂質(zhì)的固定液，用以顯示脂類（例如髓脂類）。能使單個細(xì)胞或小組織的微細(xì)構(gòu)造得以極好地保存，因此幾乎是用于電子顯微術(shù)最佳固定劑。組織經(jīng)固定后，脂肪，類脂呈黑色，微溶于二甲苯及酒精，脫水后最好以苯作透明劑。
四氧化鋨的滲透力弱。組織塊如過2－3厘米厚度則穿透不良和不均。所有含四氧化鋨固定劑的固定作用皆很不均勻；固定不良的組織切片表現(xiàn)周圍有一圈過度固定的暗色區(qū)帶；中心為固定不足致使細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)不清的區(qū)域。有些成分變暗是由于無色的OsO4 轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏衔颫sO4·5H2 O形式。
四氧化鋨常與鉻酸，醋酸，重鉻酸鉀等混合使用，固定后的組織需經(jīng)流水沖洗，否則在脫水酒精中易被還原產(chǎn)生沉淀，不利于核著色，在每10毫升溶液中內(nèi)加入1滴飽和氯化汞水溶液有助于制止還原作用。
氯化汞（又名升汞或二氯化汞HgCL2 ）
氯化汞為白色粉末或針狀結(jié)晶，后者為化學(xué)純品，易升華，能溶于水和酒精。一般固定用其飽和溶液。
氯化汞是一種能迅速透入并使組織硬化的蛋白沉淀劑。通常像別的金屬離子那樣，它與蛋白質(zhì)的酸基以及核蛋白的磷酸基相結(jié)合，亦特異地與氫硫基起反應(yīng)。因而經(jīng)Hg固定后的蛋白質(zhì)不溶于水，大多數(shù)蛋白反應(yīng)可被利用�？上�，它的透入速度于最初幾毫米后就急驟降低，因此組織塊厚度如超過5毫米常使外圍過度固定致堅硬而中心固定不足仍柔軟，只宜固定薄片組織。由于此缺點加之使組織收縮劇烈，很少單獨使用；當(dāng)與拮抗此缺點的試劑如醋酸，福爾馬林，重鉻酸鉀等結(jié)合使用時，氯化汞仍是很多優(yōu)良常規(guī)固定劑的一種成分。用氯化汞固定的組織使染色特別對胞漿著色比較鮮麗。
凡用含氯化汞的固定劑固定的組織如超過規(guī)定時間會使組織過度硬化，而難切薄片。組織內(nèi)常存有汞鹽，切片時能損傷切片刀，所以在脫水前應(yīng)予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘（0.5%）浸洗，再進行充分的沖洗或以70%酒精洗后進行脫水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗數(shù)分鐘，再以5%硫代硫酸鈉漂洗，水洗后進行染色。
氯化汞常備溶液為飽和（約7%）水溶液，固定用濃度常為5%水溶液。用升汞飽和液固定組織時，臨時須加5%冰醋酸。固定2－3mm厚的組織塊須經(jīng)6－18小時，然后用水洗24小時，再保存于80%酒精中。
氯化汞腐蝕金屬，混有此試劑的固定液不能使用金屬容器盛裝或用金屬鑷子夾持。氯化汞有劇毒，應(yīng)妥善保管。
固定劑的選擇取決于研究工作當(dāng)時和下一步的需要，在選擇混合固定劑時，應(yīng)注意各種試劑的平衡，如使組織收縮的試劑可配以使組織膨脹的試劑，滲透力弱的可與滲透力強的混合使用。但是，氧化劑原則上不與還原劑混用，如需要時，只能在使用前臨時混合。一種混合固定劑內(nèi)不宜有兩種以上的鹽類，以免產(chǎn)生復(fù)鹽影響對組織的固定，如氧化納和氯化鈉同時應(yīng)用時，常將氯化鈉改用硫酸鈉。技術(shù)工作者和病理工作者都應(yīng)了解各種固定劑的性能。固定液的選擇恰當(dāng)，才能獲得滿意的制片結(jié)果。
混合固定液的種類很多，本章內(nèi)所述的固定劑皆是較常用的，特殊染色所需的固定劑皆列在相應(yīng)的標(biāo)題下。
Miiller氏液
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
蒸餾 水加至 100ml
此液固定作用緩慢，但頗均勻，收縮亦小。多用于媒染和硬化神經(jīng)組織，在這種固定溶液中，重鉻酸鉀未經(jīng)酸化，所以對染色質(zhì)無固定作用。不適用于一般細(xì)胞學(xué)染色。除用于骨骼標(biāo)本外，此液是一種不常用的固定劑。固定時間數(shù)天至數(shù)周，在固定過程中，需要每日更換新液并置暗處，固定后的組織用流水沖洗，再放入酒精中脫水。
Orth氏液（Mullr氏液＋福爾馬林）
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
福爾馬林 10ml
蒸餾 水 加至 100ml
一般以Mullr氏液為備用液，用前以9份Mullr氏液加1份福爾馬林混合而成，因為重鉻酸鉀是氧化劑，福爾馬林為還原劑，混合后久放即失去固定作用。
固定0.5厘米的標(biāo)本塊約需3－4日，每日需更換新液，標(biāo)本固定后要充分水洗，然后進行脫水包埋。如固定過久，標(biāo)本變脆，顏色由棕黃轉(zhuǎn)變?yōu)楹谏瑒t不能制作切片，標(biāo)本經(jīng)固定后如不能及時制片時，應(yīng)將標(biāo)本保存于福爾馬林內(nèi)或70%酒精中。
Orth氏液對染色質(zhì)，線粒體有較好的固定效果。硫酸鈉在固定液中有助于滲透作用，在一般情況下，可省去不用。
Zenker氏液（以Muller液為基液加入氯化汞在臨用前再加醋酸混合而成）
配方：重鉻酸鉀 2.5g
硫酸鈉 1.0g
氯化汞 5.0g
蒸餾水 加至 100ml
冰醋酸（臨用時加入） 5ml
Muller液加入醋酸后則不能貯存，未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存較久。此液加入冰醋酸后，與重鉻酸鉀作用生成鉻酸，是蛋白質(zhì)的良好固定劑，其穿透力迅速而均勻硬化組織能力強，經(jīng)它固定后的標(biāo)本利于鹽基性染色劑著色，胞核和胞漿染色頗為清晰，是一種優(yōu)良的常規(guī)固定劑。
Zenker氏固定液中含有兩種蛋白質(zhì)和三種染色質(zhì)的固定劑：
福爾馬林（40%甲醛液） 25ml
冰醋酸 5ml
此固定液保存性良好，滲透速度快，穿透力迅速而均勻，且很少引起收縮，不使組織變硬和變脆，固定后的組織用三色染色法著色鮮艷絢麗，過量苦味酸使組織呈黃色，但并不妨礙染色，毋須洗凈除去。
此液也是皮膚組織較好的固定液，它可以軟化表皮不使其變硬變脆。利于切片，對蛋白質(zhì)核酸有較好的固定作用，一般固定時間為數(shù)小時至一日。
Carrnoy氏固定液
配方：無水酒精 60ml
氯仿 30ml
冰醋酸 10ml
此液穿透力非常塊、固定力強，對核固定良好，并可保存糖原也用于糖類的固定。于脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固定。一般組織固定2－3小時后即可直接投入95%酒精和純酒精中進行脫水，因此也可作快速固定的固定劑，厚度2－9毫米的小塊組織僅需15分鐘即可，外檢胸腹水經(jīng)過離心沉淀后，將沉淀物用Carrnoy氏液固定可制作石蠟切片。
醋酸－酒精－福爾馬林混合固定液
配方：福爾馬林 10ml
冰醋酸 5ml
70%酒精 85ml
這種混合固定液通常簡稱“AAF”固定液。使用較廣泛，配制時一般可以酒精作為溶劑，然后加入福爾馬林，醋酸。酒精可因組織種類不同而采用不同的濃度，在常規(guī)切片中，我們常采用濃度為95%酒精。
此液對糖原的固定佳良，就是說在蛋白質(zhì)成分完全固定之前可以防止糖類溶解，加入醋酸以保證蛋白質(zhì)的固定，由于酒精和福爾馬林二者皆為迅速穿透的試劑，這是一種相當(dāng)好的快速固定劑，對臨床外檢工作特別有利，福爾馬林對組織染色 效果較好，醋酸可以防止酒精而引起的收縮。常溫下，5毫米厚的組織固定4小時即可，加溫（60℃）條件下，一般組織半小時內(nèi)可固定良好，固定后組織直接放入95%酒精中脫水。
AAF固定液的缺點是組織固定后對細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)的某些結(jié)構(gòu)有一定破壞作用，而對免疫組織化學(xué)染色有一定影響（詳見免疫組織化學(xué)技術(shù)一章）。
其它常用固定液配方
10%甲醛生理鹽水液
配方：福爾馬林 100ml
氯化鈉 9.0g
蒸餾水 900ml
Gendre液
配方：苦味酸飽和于95%酒精溶液 80ml
福爾馬林 15ml
冰醋酸 5ml
用此液在室溫下3－4小時即可使糖原固定良好。
緩沖福爾馬林液
配方：福爾馬林 10ml
磷酸二氫鈉（NaH2 PO4 ·2H2 O） 0.4g
磷酸氫二鈉（Na2 HPO4 ） 0.65g
蒸餾水 100ml
緩沖福爾馬林固定劑具有能較好地保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)，適于免疫組織化學(xué)染色和電鏡觀察，并且可較長時間保存組織（半年至一年）而又不影響制片和染色。是近年來越來越受到重視的固定劑。
大體標(biāo)本的處理和固定
解剖所得的臟器標(biāo)本，可提供臨床病理討論及教學(xué)和科研之用，除對有典型的病變臟器制成標(biāo)本外，對有重要病變的臟器亦應(yīng)固定保存，條件允許可將全部臟器切成需要的大小保留。
通常所用的固定液是10%甲醛（即福爾馬林）水溶液（市售甲醛溶液用水稀釋1：9）。這樣既可使組織內(nèi)的蛋白和脂類等成分凝固，又可使組織不致腐爛。為了保存組織內(nèi)的各種水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸鹽結(jié)晶等，應(yīng)在剖驗當(dāng)時將部分臟器切成組織塊放入純酒精液固定，切不可著水。
只有細(xì)心且有計劃地進行尸體剖檢，并在切除器官后仔細(xì)處理才能獲得良好地陳列標(biāo)本。剖檢過程中的粗心和草率，很容易破壞一個有價值的標(biāo)本。因為今天的常見病明天會成為罕見病例，為此重要的是保持這些病理標(biāo)本原有的形態(tài)和色澤。有時外科手術(shù) 摘除的標(biāo)本，如經(jīng)適當(dāng)處理也可以成為最好的陳列標(biāo)本。
常規(guī)的福爾馬林固定后，大體標(biāo)本常呈灰褐色，用下述方法擬可保存大體標(biāo)本的色澤，使之更接近自然色彩。
配方：甲醛 20ml
硝酸鉀 3g
醋酸鉀 3g
生理鹽水 加至 100ml
固定時間視標(biāo)本的大小而定，一般24－72小時。固定后經(jīng)充分的流水沖洗后再放入下述保存液中長期保存。
甘油 20ml
醋酸鉀 4g
麝香草酚 0.2g
蒸餾水 加至 100ml（PH＝8）
陳列標(biāo)本的固定
一.為供日后臨床病理討論、教學(xué)和研究用的標(biāo)本，必須將有關(guān)主要病變的臟器和其它繼發(fā)變化的臟器一并保留，這樣就保持了各臟器病變的聯(lián)系性和整體性。
二.將每一尸體的內(nèi)臟放入一個較大的玻璃缸內(nèi)。這種園缸應(yīng)有緊密的玻璃蓋，使之不漏氣。缸內(nèi)先裝半缸10%甲醛液，再將需要保留的各臟器放入，一定要浸在固定劑內(nèi)，若聽任露在液面外的組織變干，則會造成一塊永久的暗色區(qū)。
三.各標(biāo)本如肝、脾和腎等應(yīng)具有一光滑平整地切面（須以鋒利的長刃刀一次切出）。輕放在缸內(nèi)，以免彎曲變形，缸內(nèi)切不可多裝標(biāo)本，特別是新鮮的軟標(biāo)本和對有教學(xué)價值的標(biāo)本要分別固定，以免擠壓、防止固定不足和變形而失去原有的特征。缸內(nèi)固定液的量是標(biāo)本體積的4－5倍。一般實質(zhì)性臟器制作標(biāo)本時，其厚度宜在1.5厘米左右，過厚則固定液不易滲透入內(nèi)，過薄則易變形翹起。
四.肺臟標(biāo)本比重較輕，易漂浮在液面，可用薄層脫脂棉花覆蓋其表面、借以棉花纖維的虹吸現(xiàn)象，可不斷地浸濕標(biāo)本。在有條件的情況下，為保證充分固定，應(yīng)盡可能向標(biāo)本內(nèi)灌注固定劑。
五.標(biāo)本放入固定液12小時后應(yīng)加以翻轉(zhuǎn)，以使標(biāo)本與缸底或缸壁接觸部分能很好浸透固定液。
六.具有空腔的臟器（如大、小腸）膜組織（如胸膜、腹膜等），皮膚等則應(yīng)在剪開后用扣針將其邊沿釘在硬紙板上，標(biāo)本朝下浸到固定液內(nèi)，以保持病變的形態(tài)，使用的扣針需防銹（也可用玻璃，竹簽或不銹鋼針）以免污染標(biāo)本。
七.囊腔組織如果沒有打開可用注射器注入固定液使之充盈；如已打開則需填入浸有固定劑的脫脂棉以保持其自然狀態(tài)。
八.被膽汁污染或含膽汁的標(biāo)本，必須分別固定貯存，否則會污染別的標(biāo)本。
九.標(biāo)本的外觀、標(biāo)簽和目錄也同樣重要，大體標(biāo)本的編號最好用布條，用碳素墨水書寫解剖號碼，然后將布條浸漬溶化的石蠟，冷卻后將標(biāo)簽系于標(biāo)本上或投入缸內(nèi)，標(biāo)本缸外面亦須貼上解剖號碼，以便隨時取驗。
十.大體標(biāo)本的保存和管理必須予以重視，應(yīng)定期加入甲醛溶液以補充平時之揮發(fā)。液體內(nèi)混和少量麝香草酚，作為防霉劑。平時也勤加管理，以防止發(fā)霉和標(biāo)本腐爛。除有明確病變需要保留的標(biāo)本外，對廢舊標(biāo)本亦須妥善處理。一般相隔3－6個月后，集中裝于草包內(nèi)焚化或深埋。
脫 鈣
組織里存有鈣鹽可妨礙用常規(guī)方法制作良好切片。骨組織及鈣化病灶，經(jīng)過固定后，必先將鈣鹽除去使組織軟化，才能進行常規(guī)切片。如脫鈣不全則切片易撕開或碎裂并損傷切片刀刃。脫去鈣鹽的過程――稱為脫鈣。脫鈣時應(yīng)注意：
1.骨組織固定24小時后，鋸下不超過0.5mm厚的薄骨片，再以10%福爾馬林固定后進行脫鈣。（未固定的組織在酸性脫鈣液中受到的損傷比已固定的組織約大三倍）。骨組織過厚則需延長脫鈣時間，長時間浸于強酸影響切片染色效果。
2.在不影響診斷的條件下，應(yīng)將骨組織周圍的軟組織全部剝?nèi)ァＨ绻衅康脑谟谟^察骨髓病變或骨組織腫瘤，最好除去一部分正常的致密的骨組織，以利于脫鈣和制片。
3.脫鈣前最好先將骨組織進行脫脂。
4.脫鈣要徹底，脫水應(yīng)充分，在脫水過程中，要注意不使其過度硬化。
脫鈣劑
優(yōu)質(zhì)脫鈣劑的標(biāo)準(zhǔn)是：
（a） 完全脫鈣。
（b） 不損傷組織細(xì)胞或纖維。
（c） 不妨礙以后的染色技術(shù)。
（d） 適當(dāng)?shù)拿撯}速度。
一、強酸脫鈣劑
1.含甲酸脫鈣液
Gooding和Stewart氏液（甲酸－福爾馬林液）
配方：甲酸 5－25ml
福爾馬林 5ml
蒸餾水 加至 100ml
5%的甲酸是一種良好的常規(guī)脫鈣劑，速度適當(dāng)，組織損害小。當(dāng)甲酸成分增至25%則增快脫鈣速度，加入甲醛可適當(dāng)保護組織不受酸損害，但應(yīng)切記，增加脫鈣速度只能靠犧牲細(xì)胞微細(xì)構(gòu)造來獲得。
根據(jù)組織的厚度和鈣化程度，在5％甲酸液內(nèi)2－4天可完全脫鈣，橫切的肋骨需36－48小時。
2.含鹽酸脫鈣液
Von Ebner氏液
配方：濃鹽酸 15ml
氯化鈉 7.5ml
蒸餾水 加至 100ml
鹽酸脫鈣易使組織收縮，作用速度較快，用氯化鈉作為溶劑則效果良好，牙齒脫鈣時鹽酸可增至10－20%。脫鈣時，每日應(yīng)加鹽酸（0.5%）直至完成脫鈣，橫切的人肋骨（5毫米厚度）于36－72小時內(nèi)脫鈣。
3． 硝酸脫鈣液
是最常用的脫鈣劑，用硝酸作脫鈣液的缺點是形成亞硝酸而使溶液呈黃色，產(chǎn)生顏色即迅速影響脫鈣速度，且組織的黃染會妨礙隨后的染色反應(yīng)。在硝酸內(nèi)加入0.1％尿素可以防止變黃而使之無色，但尿素僅有暫時作用，一旦硝酸顯淡黃時需要加入。
福爾馬林－硝酸液（Clayden氏液）
配方：福爾馬林 5ml
硝酸（比重1.41） 7.5－15ml
蒸餾水 加至 100ml
此處方中甲醛可部分地抑制硝酸的浸軟作用，這即具有脫鈣作用，又具有固定作用，硝酸脫鈣迅速，組織不膨脹，掌握好脫鈣時間可直接脫水，不影響染色效果。但最好先洗去硝酸。
橫切人肋骨（5mm）用含7.5％硝酸液于1－2天內(nèi)脫鈣。
硝酸水溶液
配方：硝酸（用0.1尿素穩(wěn)定） 5－10ml
蒸餾水 加至 100ml
此液用作常規(guī)脫鈣劑，作用迅速，對組織不膨脹，對細(xì)胞的保存和染色比前者更好，能適用多種染色技術(shù)，但每日需要更換新鮮溶液，最好早晚各一次，一般1－3天完成。
橫切人肋骨（5mm）在12－24小時內(nèi)脫鈣。
二、螯合劑脫鈣
乙二胺四乙酸（EDTA ）是用以脫鈣地螯合劑。為有機化合物，有結(jié)合某些金屬的能力，能結(jié)合鈣鹽，15%的溶液即起脫鈣作用，組織用此方法脫鈣，對組織破壞性小，即放置數(shù)月亦不致引起對組織的破壞，對以后大多數(shù)的染色技術(shù)皆可得到滿意結(jié)果。
經(jīng)10%中性福爾馬林鹽固定后，將組織移到50倍用磷酸鹽緩沖劑緩沖至PH值等于7的5.5％EDTA 內(nèi)。
不超過5毫米厚度的小塊組織在此液內(nèi)每4－5天換液一次，更換三次后再每天換液一次以便較準(zhǔn)確的確定脫鈣終點。脫鈣“終點”可用X射線方法或用草酸鹽化學(xué)方法。
完全脫鈣后將組織直接移到70%酒精內(nèi)常規(guī)脫水，浸蠟，石蠟或火棉膠包埋。
三、脫鈣步驟
1．取材：骨組織固定于10%福爾馬林24小時后再鋸取厚度約0.5厘米骨片。
2．固定：再以10%福爾馬林固定2天。
3．將組織置于脫鈣劑中，每日更換新鮮液、直至組織軟化為止。
4．流水沖洗24小時（除酸）。
5．進行常規(guī)脫水，透明，浸蠟，切片。
四、鑒定脫鈣是否徹底
確定脫鈣“終點”三種方法：
1. 最常用的是最簡單的方法――針刺，如果很容易被刺透，而且不感到阻力時，說明組織基本上脫鈣完全，否則應(yīng)繼續(xù)脫鈣�？拷M織的柔軟性測驗脫鈣作用靠不住，而且這種插入一根針以察覺鈣沉淀的方法會造成組織損傷。
2．用X射線檢查：看組織內(nèi)是否仍有鈣質(zhì)。
3．用化學(xué)實驗檢查：
取5ml脫鈣液用2M的NaOH（氫氧化鈉）調(diào)整至中性，再加5％草酸鈉或草酸銨1ml，液體混濁表示有鈣質(zhì)。遲至5分鐘仍不混濁表示脫鈣液中不含有鈣質(zhì)。
組織中仍有鈣質(zhì)時，一定量的鈣離子會溶于脫鈣液中，游離的鈣會干擾脫鈣作用的完成。顯然，應(yīng)在每次試驗時完全更換，再試驗中必須經(jīng)過2－3小時間隔讓鈣溶解。
五．酸的中和
脫鈣后水洗24小時，目的是除去組織中經(jīng)無機酸浸漬后過多的酸，以免影響染色。再沖洗前應(yīng)將組織用一種堿處理以使之脫酸呈中性，可用5％硫酸鉀或硫酸鈉處理過夜。（否則會引起組織膨脹）但直接轉(zhuǎn)移到稀酒精（70％）內(nèi)過12－18小時換液2次，再繼續(xù)脫水，經(jīng)無水酒精，氯仿透明，石蠟包埋，切片，整個過程其酸已全部除去，在多數(shù)情況下不僅不膨脹且對染色反應(yīng)能有所改善。因此不沖洗對染色也沒大礙，只是脫水劑被酸化。
組織的沖洗
組織經(jīng)過固定后，脫水之前應(yīng)進行沖洗，將組織內(nèi)的固定液洗干凈，否則殘留組織內(nèi)的固定液有礙制片和染色，而有些固定液則可在組織中繼續(xù)起到脆化組織的作用，以至于損壞組織，給制片工作帶來不利。在沖洗時，沖洗劑的選擇應(yīng)依固定液的種類和性質(zhì)而有所不同。
沖洗時應(yīng)注意以下事項：
1.水溶性的固定劑：需用流水沖洗。
2.酒精溶劑的固定劑：應(yīng)用同濃度的酒精浸洗。
3.含苦味酸的固定劑：（苦味酸與甲醛混合液除外），須用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失。
4.含有升汞固定劑：組織經(jīng)固定后應(yīng)在沖洗劑－水或酒精中加碘以洗去組織內(nèi)汞的沉淀。
含有鉻酸的固定劑：組織在沖洗時最好置于暗處，以免產(chǎn)生沉淀或使組織硬化而影響制片。
