了解原生質(zhì)體融合技術(shù)的原理.

    學(xué)習(xí)并掌握以細(xì)菌為材料的原生質(zhì)體融合技術(shù).

 

二、基本原理:

    原核微生物基因重組主要可通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等途徑,但有些微生物不適于采用這些途徑,從而使育種工作受到一定的限制.1978 年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會(huì)上,有人提出微生物細(xì)胞原生質(zhì)體融合這一新的基因重組手段.由于它具有許多特殊優(yōu)點(diǎn),所以,目前已為國內(nèi)外微生物育種工作所廣泛研究和應(yīng)用.

(一) 原生質(zhì)體融合的優(yōu)點(diǎn):

1、克服種屬間雜交的“不育性”,可以進(jìn)行遠(yuǎn)緣雜交.由于用酶解除去細(xì)胞壁,因此,即使相同接合型的真菌或不同種屬間的微生物,皆可發(fā)生原生質(zhì)體融合,產(chǎn)生重組子.

2、基因重組頻率高,重組類型多.原生質(zhì)體融合時(shí),由于聚乙二醇(PEG)起促融合的作用,使細(xì)胞相互聚集,可以提高基因重組率.原生質(zhì)體融合后,兩個(gè)親株的整套基因組 (包括細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì))相互接觸,發(fā)生多位點(diǎn)的交換,從而產(chǎn)生各種各樣的基因組合,獲得多種類型的重組子.

3、可將由其他育種方法獲得的優(yōu)良性狀,經(jīng)原生質(zhì)體融合而組合到一個(gè)菌株中.

4、存在著兩個(gè)以上親株同時(shí)參與融合,可形成多種性狀的融合子.

(二) 原生質(zhì)體融合步驟:

1、選擇親本:選擇兩個(gè)具有育種價(jià)值并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的菌株作為親本.

2、制備原生質(zhì)體:經(jīng)溶菌酶除去細(xì)胞壁,釋放出原生質(zhì)體,并置高滲液中維持其穩(wěn)定.

3、促融合:聚乙二醇加入到原生質(zhì)體以促進(jìn)融合.聚乙二醇為一種表面活性劑,能強(qiáng)制性的促進(jìn)原生質(zhì)體融合.在有Ca2+ 、Mg2+離子存在時(shí),更能促進(jìn)融合.

4、原生質(zhì)體再生:原生質(zhì)體已失去細(xì)胞壁,雖有生物活性,但在普通培養(yǎng)基上不生長,必須涂布在再生培養(yǎng)基上,使之再生.

5、檢出融合子:利用選擇培養(yǎng)基上的遺傳標(biāo)記,確定是否為融合子.

6、融合子篩選:產(chǎn)生的融合子中可能有雜合雙倍體和單倍重組體不同的類型,前者性能不穩(wěn)定,要選出性能穩(wěn)定的單倍重組體,反復(fù)篩選出生產(chǎn)性能良好的融合子.

(三) 原生質(zhì)體再生率和融合率計(jì)算

 

三、實(shí)驗(yàn)材料:

(一) 菌種:

    枯草芽孢桿菌T4412 ade- his-、枯草芽孢桿菌TT2 ade-pro-

(二) 培養(yǎng)基(見附錄):

1、完全培養(yǎng)基(CM,液體);

2、完全培養(yǎng)基(CM,固體) 液體培養(yǎng)基中加入2.0%瓊脂;

3、基本培養(yǎng)基(MM);

4、補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SM) 在基本培養(yǎng)基中加入20 g/mL 的腺嘌呤及2％的純化瓊脂,75 Pa 滅菌20min;

5、再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SMR) 在補(bǔ)充基本培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L 蔗糖,1.0％純化瓊脂作上層平板,2.0％純化瓊脂作底層平板、75 Pa 滅菌20 min.

6、酪蛋白培養(yǎng)基(測蛋白酶活性用).

(三) 緩沖液:

1、0.1mol/L pH 6.0 磷酸緩沖液.

2、高滲緩沖液:于上述緩沖液中加入0.8 mol/L 甘露醇.

(四) 原生質(zhì)體穩(wěn)定液(SMM):

    0.5 mol/L 蔗糖、20 mol/L MgC1 、0.02 mol/L 順丁烯二酸,調(diào)pH 6.5.

(五) 促融合劑:

    40％聚乙二醇(PEG-4000)的SMM 溶液.

(六) 溶菌酶液:

    酶粉酶活為4000 u/g,用SMM 溶液配制,終濃度為2 mg/mL,過濾除菌備用.

(七)器皿:

    培養(yǎng)皿、移液管、試管、容量瓶、錐形瓶、燒杯、離心管、吸管、顯微鏡、臺(tái)式離心機(jī)、721 比色計(jì)、細(xì)菌過濾器.

四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容:

(一) 原生質(zhì)體的制備:

1、培養(yǎng)枯草芽孢桿菌:

    取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環(huán)到裝有液體完全培養(yǎng)基(CM)的試管中,36℃振蕩培養(yǎng)14 h,各取1 mL 菌液轉(zhuǎn)接入裝有20 mL 液體完全培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中,36℃振蕩培養(yǎng) 3 h,使細(xì)胞生長進(jìn)入對數(shù)前期,各加入25 u/mL 青霉素,使其終濃度為0.3 u/mL,繼續(xù)振蕩培養(yǎng)2 h.

2、收集細(xì)胞:

    各取菌液10 mL,4000 r/min 離心10 min,棄上清液,將菌體懸浮于磷酸緩沖液中,離心.如此洗滌兩次,將菌體懸浮10 mL SMM 中,每mL 約含108～109 活菌為宜.

3、總菌數(shù)測定:

    各取菌液0.5 mL,用生理鹽水稀釋,取10-5、10-6、10-7 各1mL(每稀釋度作兩個(gè)平板)、傾注完全培養(yǎng)基,36℃培養(yǎng)24 h 后計(jì)數(shù).此為未經(jīng)酶處理的總菌數(shù).

4、脫壁:

    二株親本菌株各取5 mL 菌懸液,加入5 mL 溶菌酶溶液,溶菌酶濃度為100 ug/mL,混勻后于36℃水浴保溫處理30 min,定時(shí)取樣,鏡檢觀察原生質(zhì)體形成情況,當(dāng)95%以上細(xì)胞變成球狀原生質(zhì)體時(shí),用4000 r/min 離心10 min,棄上清液,用高滲緩沖液洗滌除酶,然后將原生質(zhì)體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中.立即進(jìn)行剩余菌數(shù)的測定.

5、剩余菌數(shù)測定:

    取0.5 mL 上述原生質(zhì)體懸液,用無菌水稀釋,使原生質(zhì)體裂解死亡,取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL,涂布于完全培養(yǎng)基平板上,36℃培養(yǎng)24～48 h,生長出的菌落應(yīng)是未被酶裂解的剩余細(xì)胞.

    計(jì)算酶處理后剩余細(xì)胞數(shù),并分別計(jì)算二親株的原生質(zhì)體形成率.原生質(zhì)體形成率＝未經(jīng)酶處理的總菌數(shù)一酶處理后剩余細(xì)胞數(shù)

(二) 原生質(zhì)體再生:

    用雙層培養(yǎng)法,先倒再生補(bǔ)充基本固體培養(yǎng)基(SMR)作底層,取0.5 mL 原生質(zhì)體懸液,用SMM作適當(dāng)稀釋,取10-3、10-4、10-5 稀釋液各1mL,加入底層平板培養(yǎng)基的中央,再倒入上層再生補(bǔ)充半固體培養(yǎng)基混勻,36℃培養(yǎng)48 h.分別計(jì)算二親株的原生質(zhì)體的再生率,并計(jì)算其平均數(shù).

(三) 原生質(zhì)體融合:

    取兩個(gè)親本的原生質(zhì)體懸液各1 mL 混合,放置5 min 后,2500 r/min 離心10 min,棄上清液.于沉淀中加入0.2 mL SMM 溶液混勻,再加入1.8 mL PEG 溶液,輕輕搖勻,置36℃水浴保溫處理2 min,2500 r/min 離心10 min,收集菌體,將沉淀充分懸浮于2 mL SMM 液中.

(四) 檢出融合子:

    取0.5 mL 融合液,用SMM 液作適當(dāng)稀釋,取0.1 mL 菌液與滅菌并冷卻至50℃的再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基軟瓊脂中混勻,迅速傾入底層為再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基的平板上,36℃培養(yǎng)2 d,撿出融合子,轉(zhuǎn)接傳代,并進(jìn)行計(jì)數(shù),計(jì)算融合率.

(五) 融合子的篩選:

    挑選遺傳標(biāo)記穩(wěn)定的融合子,凡是在再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基平板上長出的菌落,初步認(rèn)為是融合子,可接入到酪蛋白培養(yǎng)基平板上,再挑選蛋白酶活性高于親本的融合 子.由于原生質(zhì)體融合后會(huì)出現(xiàn)兩種情況:一種是真正的融合,即產(chǎn)生雜核二倍體或單倍重組體,另一種只發(fā)生質(zhì)配,而無核配,形成異核體.兩者都能在再生基本 培養(yǎng)基平板上形成菌落,但前者穩(wěn)定,而后者則不穩(wěn)定.故在傳代中將會(huì)分離為親本類型.所以要獲得真正融合子,必須進(jìn)行幾代的分離、純化和選擇.

附錄 細(xì)菌原生質(zhì)體融合試驗(yàn)用培養(yǎng)基

1、完全培養(yǎng)基(CM):

    蛋白胨   1 g

    葡萄糖   1 g

    酵母粉   0.5 g

    牛肉膏  0.5 g

    NaCl      0.5 g

    蒸餾水 100 mL

    pH 7.2

    100 Pa 滅菌20 min.

    如需配制固體完全培養(yǎng)基時(shí),則需在上述液體培養(yǎng)基中加入2％瓊脂.

 

2、基本培養(yǎng)基(MM):

    葡萄糖                      0.5 g

    (NH4)2SO4              0.2 g

    檸檬酸鈉                  0.1 g

    K2HPO4·3H2O       1.4 g

    KH2PO4                  0.6 g

    MgSO4·7H2O          0.02 g

    蒸餾水                     100 mL

    純化瓊脂                 2 g

    pH 7.0

    100 Pa 滅菌20 min.

 

3、高滲再生培養(yǎng)基(CMR):

    蛋白胨 1 g

    葡萄糖 0.5 g

    酵母粉 0.5 g

    牛肉膏 0.5 g

    NaCl     0.5 g

    蔗糖     0.5 mol/L

    MgCl2  20 mmol/L

    純化瓊脂 2 g

    pH 7.0

    100 Pa 滅菌20 min.

    如配上層固體培養(yǎng)基,需在上述液體培養(yǎng)基中加入0.6％瓊脂.如需配底層固體培養(yǎng)基,則需加入2％瓊脂.

 

4、補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SM):

    在基本培養(yǎng)基中加入20 ug/mL 腺漂吟及2％純化瓊脂.

    70Pa 滅菌20 mm.

 

5、再生補(bǔ)充基本培養(yǎng)基(SMR):

    在補(bǔ)充基本培養(yǎng)基中加入0.5 mol/L 蔗糖及2％純化瓊脂.

    70 Pa 滅菌 20 min.

 

6、酪蛋白培養(yǎng)基(測蛋白酶活性用):

    Na2HPO4·12H2O   0.13 g

    KH2PO4                  0.036 g

    NaCl                         0.01 g

    ZnSO4·7H2O           0.002 g

    CaCl2·2H2O             0.0002 g

    酪素              0.4 g

    酪素水解氨基酸    0.005 g

    瓊脂              1.5～2 g   

    蒸餾水            100 mL

    pH 7.2

    100 Pa 滅菌20 min.

 

7、0.1 mol/L 磷酸緩沖液(pH 6.0、pH 7.0):

    K2HPO4 相對分子質(zhì)量＝174.18,0.1 mol/L 溶液為17.4g/L,稱取17.4 g K2HPO4,溶解于蒸餾水中,定容至1000 mL.

    KH2PO4 相對分子質(zhì)量＝136.09,0.1 mool/L 溶液為13.6 g,稱取13.6 g KH2PO4, 溶解于蒸餾水中,定容至1000mL.

    蒸餾水 100 mL